16394.家兔高效基因敲除技術(shù)體系的建立

1、國幽中國科學(xué)院大學(xué)UniversityofChineseAcademyofSciences博士學(xué)位論文密級(jí)：2013年05月摘要摘要兔是標(biāo)準(zhǔn)的生物醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。它繁殖快、飼養(yǎng)成本低，體型適中，適合于進(jìn)行反復(fù)活體監(jiān)測、采樣等操作和大樣品量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的收集；其生理結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)發(fā)育也比嚙齒類動(dòng)物更接近于人類，尤其是比小鼠等能更真實(shí)地模擬人類疾病的發(fā)病機(jī)制，目前已經(jīng)成為多種人類疾病模型和發(fā)育機(jī)制研究模型的首選。然而由于缺少完整的基因組信息和高效

2、的基因修飾技術(shù)，使得轉(zhuǎn)基因兔不能像轉(zhuǎn)基因小鼠一樣大量生產(chǎn)，限制了轉(zhuǎn)基因兔的應(yīng)用。傳統(tǒng)的基因定點(diǎn)修飾技術(shù)是胚胎干細(xì)胞與同源重組相結(jié)合，利用嵌合體胚胎獲得目的基因修飾的動(dòng)物；而對于沒有獲得胚胎干細(xì)胞的動(dòng)物來說，可以在體細(xì)胞上利用同源重組技術(shù)獲得目的基因修飾的陽性細(xì)胞，再經(jīng)過體細(xì)胞核移植的手段獲得成活的動(dòng)物。但是對于家兔這種既沒有獲得能夠生殖系傳遞的胚胎干細(xì)胞，克隆效率又極低的物種來說，獲得期望的基因定點(diǎn)修飾動(dòng)物是極其困難的。然而，鋅指核糖核

3、酸酶(ZFNs)與轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了基因定點(diǎn)修飾動(dòng)物的研究，為這些克隆效率低下又缺少全能胚胎干細(xì)胞物種的基因修飾開辟了新渠道。隨著ZFNs和TALENs技術(shù)的不斷發(fā)展，基因修飾兔將逐步發(fā)揮其優(yōu)勢，為人類疾病、藥物開發(fā)、發(fā)育機(jī)制等研究提供更加有效的動(dòng)物模型。本研究致力于建立家兔基因修飾的技術(shù)體系，利用目前高效打靶的TALENs和ZFNs技術(shù)分別構(gòu)建了RAG基因敲除兔和CETP基因敲除兔，兩種基因敲

4、除兔的成功構(gòu)建，為我們獲得其他基因修飾的兔模型以及對兔自身基因的深入研究提供了技術(shù)平臺(tái)。我們利用TALENs技術(shù)首次獲得了RAG基因敲除兔，在此過程中，TALENs的基因修飾效率相比常用的同源重組結(jié)合原核注射技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢，只需一次修飾就可以獲得雙等位基因敲除兔，兩對TALENs效率分別達(dá)到611％和467％，單敲除的比例則達(dá)到驚人的90％以上。在獲得的雙等位基因突變的F0代兔中，部分表現(xiàn)出明顯的RAG缺陷癥狀，例如：胸腺脾臟器官發(fā)