家蠶安全高效轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系的研究——家蠶定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因體系的建立及應(yīng)用.pdf

1、為了有效克服轉(zhuǎn)基因家蠶可能帶來的生物安全問題，本論文首先建立了基于FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的家蠶轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)刪除技術(shù)，利用該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因家蠶基因組中篩選標(biāo)記基因的高效、可誘導(dǎo)的定點(diǎn)刪除，從而有效克服篩選標(biāo)記基因的保留所帶來的潛在生物安全隱患;隨后建立了基于phiC31整合酶介導(dǎo)的盒式交換(phiC31-RMCE)系統(tǒng)的家蠶轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)整合技術(shù)，利用該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)不同外源基因在轉(zhuǎn)基因家蠶基因組預(yù)先建立靶位點(diǎn)的定點(diǎn)整合，從而有效消除

2、轉(zhuǎn)座子隨機(jī)整合位置效應(yīng)對(duì)外源基因表達(dá)的影響;最后聯(lián)合位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)及改造的復(fù)合型piggyBac轉(zhuǎn)座載體，開發(fā)了一項(xiàng)通用且有效的轉(zhuǎn)基因在家蠶基因組穩(wěn)定整合、表達(dá)以及可精確替換的策略，并利用該策略成功地建立了一種穩(wěn)定、可置換型高效轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺表達(dá)系統(tǒng)。論文獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.家蠶轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)刪除技術(shù)的建立
　　通過胚胎顯微注射，首先篩選并建立了1個(gè)FLp/FRT系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因靶品系（Transgenic targ

3、etstrain，TTS）。分子鑒定結(jié)果顯示，TTS家蠶基因組中含有單拷貝的被FRT位點(diǎn)錨定的A3-EGFP-SV40表達(dá)框。通過胚胎顯微注射FLP基因mRNA或重組酶瞬時(shí)表達(dá)載體pSLA3-FLP的方式引入FLP重組酶的表達(dá)，在TTS家蠶后代蛾圈中成功篩選到了A3-EGFP-SV40表達(dá)框被定點(diǎn)刪除的位點(diǎn)特異性重組品系(Site-specific recombination strain，SSRS)家蠶個(gè)體。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，通過注射mR

4、NA獲得含有SSRS家蠶的陽性蛾圈的概率(13.3％)要明顯高于注射pSLA3-FLP獲得陽性蛾圈的概率(2.38％)。
　　隨后同樣通過胚胎顯微注射，分別篩選并建立了1個(gè)利用家蠶肌動(dòng)蛋白Actin3基因啟動(dòng)子調(diào)控FLP重組酶表達(dá)(A3-FLP)的重組酶表達(dá)輔助品系(H-A-1)和1個(gè)利用果蠅hsp70基因啟動(dòng)子調(diào)控FLP重組酶表達(dá)(Hsp70-FLP)的重組酶表達(dá)輔助品系（H-H-1），期望通過將TTS家蠶與H-A-1家蠶雜交的

5、方式，在TTS&H-A-1雙轉(zhuǎn)基因家蠶體內(nèi)引入FLP重組酶的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)A3-EGFP-SV40表達(dá)框在TTS&H-A-1家蠶后代的高效刪除;期望通過將TTS家蠶與H-H-1家蠶雜交并進(jìn)行42℃熱激處理（Heat shock treatment，HST）的方式，在TTS&H-H-1雙轉(zhuǎn)基因家蠶體內(nèi)引入FLP重組酶的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)A3-EGFP-SV40表達(dá)框在TTS&H-H-1家蠶后代的可誘導(dǎo)刪除。在進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)之前，首先檢查了FLP重組

6、酶在H-A-1和H-H-1家蠶體內(nèi)的表達(dá)情況。RT-PCR和qRT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)LP重組酶在H-A-1家蠶的脂肪體、中腸、絲腺、精巢、卵巢和胚胎等組織中均能高效表達(dá);而通過42℃熱激處理能夠使FLP重組酶在H-H-1家蠶上述各組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，其中在精巢、卵巢和胚胎中的表達(dá)水平上調(diào)了58.2％～72.3％。
　　統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，通過有性雜交引入FLP重組酶的方式，在TTS&H-A-1家蠶后代蛾圈中篩選獲得含有SSR

7、S家蠶的陽性蛾圈的概率達(dá)到了97.01％～100％;經(jīng)熱激處理的TTS&H-H-1家蠶后代蛾圈中的陽性蛾圈概率(32.14％～36.67％)要顯著高于未經(jīng)熱激處理的TTS&H-H-1家蠶后代蛾圈中的陽性蛾圈概率(2.63％～6.67％)。隨后，分別提取TTS家蠶和SSRS家蠶的基因組進(jìn)行分子鑒定，鑒定結(jié)果顯示位點(diǎn)特異性重組事件精確地發(fā)生于TTS家蠶基因組2個(gè)FRT位點(diǎn)之間，重組反應(yīng)沒有引起任何的突變或染色體結(jié)構(gòu)變異。
　　利用上述

8、研究的策略和方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因家蠶篩選標(biāo)記基因的高效、可誘導(dǎo)的定點(diǎn)刪除，從而有效地消除篩選標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)基因家蠶基因組的保留對(duì)基因功能研究帶來的影響及潛在的生物安全隱患。
　　2.家蠶轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)整合技術(shù)的建立
　　通過胚胎顯微注射，首先分別篩選并建立了1個(gè)基因組中含有attP/attP位點(diǎn)對(duì)的G1代phiC31/att系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因靶品系TTS1-P和1個(gè)基因組中含有attB/attB位點(diǎn)對(duì)的G1代phiC31/att系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因

9、靶品系TTS1-B。分子鑒定結(jié)果顯示，TTS1-P和TTS1-B家蠶基因組中分別含有單拷貝的attP/attP和attB/a ttB位點(diǎn)對(duì)，插入位點(diǎn)分別定位于第20號(hào)（常染色體）和第1號(hào)（Z染色體）染色體。通過先回交再自交的制種方式，將TTS1-P和TIS1-B家蠶連續(xù)培養(yǎng)7代，最終獲得了純合的G8代TTS8-P雄蛾與雌蛾（基因型分別為+A+A♂和+A+A♀，字母“A”表示轉(zhuǎn)基因，下同），以及純合的G8代TTS8-B雄蛾(ZAZA♂)與

10、雜合的G8代TTS8-B雌蛾(ZAW♀)。
　　通過顯微注射將phiC31整合酶mRNA或整合酶瞬時(shí)表達(dá)載體pSLA3-Int以及相應(yīng)的含有被attB位點(diǎn)或attP位點(diǎn)錨定的3×P3-EGFP表達(dá)框的供體質(zhì)粒(pSL{attB1-3×P3-EGFP-SV40-attB2}或pSL{attP1-3×P3-EGFP-SV40-attP2））導(dǎo)入TTS9-P或TTS9-B家蠶胚胎，在TTS10蛾圈中篩選獲得含有位點(diǎn)特異性整合品系(Sit

11、e-specificintegration strain，SSIS)家蠶（SSIS1-P或SSIS1-B）的陽性蛾圈的概率為3.84％～7.01％。分子鑒定結(jié)果顯示，3×P3-EGFP表達(dá)框在篩選到的所有SSIS1-P和SSIS1-B家蠶中，均是通過RMCE反應(yīng)整合至基因組靶位點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因蠶染色體上的attP/attP靶位點(diǎn)對(duì)和供體質(zhì)粒上的attB/attB位點(diǎn)對(duì)之間的RMCE效率，比轉(zhuǎn)基因蠶染色體上的attB/attB靶位

12、點(diǎn)對(duì)和供體質(zhì)粒上的attP/attP位點(diǎn)對(duì)之間的RMCE效率高。熒光篩選和分子檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，位點(diǎn)特異性整合的轉(zhuǎn)基因在SSIS家蠶后代基因組中能夠穩(wěn)定的遺傳和表達(dá)。
　　利用本研究建立的phiC31-RMCE系統(tǒng)可介導(dǎo)外源基因在轉(zhuǎn)基因家蠶基因組預(yù)先建立的靶位點(diǎn)的定點(diǎn)整合，從而有效克服轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因隨機(jī)整合位置效應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)及基因功能研究帶來的影響。
　　3.一種穩(wěn)定、可置換的安全高效家蠶轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)的建立
　　構(gòu)

13、建含有4個(gè)轉(zhuǎn)座子臂序列（L1、L2、R1和R2）、轉(zhuǎn)座酶基因表達(dá)框(Hsp70-PBase-SV40)、篩選標(biāo)記基因（3×P3-DsRed和3×P3-EGFP）及被attP位點(diǎn)錨定的FibH-EGFP-LBS表達(dá)框的復(fù)合型piggyBac轉(zhuǎn)座載體PB-TP。通過顯微注射將PB-TP與轉(zhuǎn)座酶表達(dá)輔助載體pHA3PIG共同導(dǎo)入非滯育的871品系G0代家蠶受精卵，篩選并建立了4個(gè)同時(shí)含有3種不同熒光表型（3×P3-DsRed，用R表示;Fib

14、H-EGFP，用g表示;3×P3-EGFP，用G表示）的G1代轉(zhuǎn)基因品系TS1-RgG1-TS1-RgG4。分子鑒定結(jié)果顯示，TS1-RgG1和TS1-RgG2家蠶基因組中均含有單拷貝的4個(gè)完整轉(zhuǎn)座子臂結(jié)構(gòu)及被attP位點(diǎn)錨定的FibH-EGFP-LBS表達(dá)框序列，其中TS1-RgG2家蠶繭絲中的外源蛋白表達(dá)量最高，純EGFP蛋白占繭絲總蛋白含量(w/w)的16％以上。
　　將TS1-RgG2蠶蛾與871蠶蛾回交產(chǎn)生的G2代蠶卵分

15、為3組，1＃組正常飼養(yǎng)用作對(duì)照，剩下2組分別在胚胎發(fā)育階段（2＃組）和幼蟲發(fā)育階段（3＃組）進(jìn)行42℃熱激處理。從成活的G2代蠶蛾中篩選同時(shí)含有3種熒光表型的TS2-RgG2轉(zhuǎn)基因蠶蛾，將其與871回交產(chǎn)生G3代蠶卵，在G3代幼蟲中篩選僅含有FibH-EGFP熒光表型（g表型）的TS3-g2家蠶個(gè)體，并統(tǒng)計(jì)含有TS3-g2家蠶的陽性蛾圈的概率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，從2＃組和3＃組中篩選到含有TS3-g2家蠶的陽性蛾圈的概率分別為16.22％(

16、6/37)和2.22％(1/45)，而在未經(jīng)熱激處理的1＃組中并沒有篩選到含有TS3-g2家蠶的陽性蛾圈。分子鑒定結(jié)果顯示，TS3-g2家蠶基因組中保留了完整的被attP位點(diǎn)錨定的FibH-EGFP-LBS表達(dá)框序列，而不再含有任何的轉(zhuǎn)座子元件序列。piggyBac轉(zhuǎn)座子的再轉(zhuǎn)座沒有引起切除的TTAA位點(diǎn)或attP位點(diǎn)附近的DNA序列發(fā)生任何突變或染色體結(jié)構(gòu)變異。
　　統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在胚胎發(fā)育階段進(jìn)行42℃熱激處理的實(shí)驗(yàn)組中篩

17、選獲得含有TS5-g2家蠶的陽性蛾圈的概率最高，達(dá)到了70％～80％。該結(jié)果證實(shí)，在轉(zhuǎn)基因家蠶胚胎發(fā)育階段，利用42℃進(jìn)行持續(xù)且反復(fù)多次的熱激處理，是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子序列在其后代家蠶基因組中刪除的最有效方法。
　　利用上述方法不但能夠有效消除piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因在家蠶基因組整合的不穩(wěn)定現(xiàn)象和篩選標(biāo)記基因、轉(zhuǎn)座子骨架序列保留所帶來的生物安全隱患，而且還能夠利用位于目的基因表達(dá)框兩端的2個(gè)同向排列的attP位點(diǎn)，通過phiC3