棉花黃萎病菌高效基因敲除體系的建立與Thit功能的研究.pdf

1、目的：棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的危害極其嚴(yán)重的土傳維管束真菌病害，每年給我國(guó)棉花生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。該病用藥劑難于防治，成為棉花生產(chǎn)發(fā)展的瓶頸。提高棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗病性是亟待解決的問(wèn)題。然而，大麗輪枝菌致病機(jī)理的研究仍停留在初步探索階段，病程關(guān)鍵基因的研究也較少。同時(shí)，大麗輪枝菌野生型菌株基因打靶效率低，阻礙了大麗輪枝菌病程關(guān)鍵基因的研究。因此，建立高效的大麗輪枝菌基因敲除體系分析病程關(guān)鍵基因的功能，并利用RNAi技術(shù)沉默寄

2、主體內(nèi)大麗輪枝菌病程關(guān)鍵基因可為防治棉花黃萎病提供技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。
　　方法：本研究利用 In-Fusion克隆技術(shù)構(gòu)建同源重組載體和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麗輪枝菌遺傳轉(zhuǎn)化的方法建立高效的大麗輪枝菌基因敲除體系。并利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和質(zhì)譜-色譜等技術(shù)方法研究大麗輪枝菌質(zhì)膜蛋白（硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的功能，同時(shí)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建RNAi載體，轉(zhuǎn)化本生煙。
　　結(jié)果和結(jié)論：1.利用同源重組和大量的轉(zhuǎn)化子篩選獲得大麗輪枝菌

3、ΔVdKu70缺陷突變體，對(duì)其進(jìn)行功能分析，結(jié)果表明ΔVdKu70缺陷突變體菌株與野生型菌株相比，其形態(tài)特征（菌落直徑、生長(zhǎng)率、孢子產(chǎn)量）和致病力基本一致。選擇三個(gè)潛在的毒素基因Vd2-OdE2、VdFreB、VdFre6作為敲除的靶基因分析ΔVdKu70缺陷突變體菌株的同源重組頻率。結(jié)果顯示ΔVdKu70缺陷突變體菌株的基因打靶效率相比野生型提高了22.8％-34.7%，顯著提高了基因打靶效率，實(shí)現(xiàn)了靶基因的精確打靶，為大麗輪枝菌致病

4、關(guān)鍵靶基因的研究提供了實(shí)驗(yàn)背景菌株，建立了高效大麗輪枝菌基因敲除突變體的轉(zhuǎn)化體系。
　　2.利用同源重組和轉(zhuǎn)化子篩選獲得大麗輪枝菌硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因敲除突變體菌株，命名為ΔVdThit。ΔVdThit突變體菌株的形態(tài)學(xué)特征（菌落直徑、生長(zhǎng)率、孢子產(chǎn)量、孢子萌發(fā)率）分析結(jié)果表明：ΔVdThit突變體菌株的生長(zhǎng)能力和生殖能力表現(xiàn)出顯著缺陷。ΔVdThit突變體菌株的逆境脅迫結(jié)果表明：ΔVdThit突變體菌株對(duì)逆境脅迫（紫外照射、活性氧

5、壓力、高滲透壓）的敏感性增強(qiáng)。
　　3.以本氏煙為寄主檢測(cè)ΔVdThit突變體的毒力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)寄主植株的感病程度顯著降低，并利用qPCR檢測(cè)寄主體內(nèi)的真菌生物量及寄主莖段的離體培養(yǎng)，結(jié)果顯示其毒力顯著降低。同時(shí)從細(xì)胞生物學(xué)方面利用熒光顯微鏡觀(guān)察VdΔThit-GFP菌株入侵和定殖過(guò)程，結(jié)果顯示在寄主入侵過(guò)程中出現(xiàn)顯著的缺陷。通過(guò) HPLC-MS和GC-MS探索ΔVdThit突變體毒力降低的機(jī)制，結(jié)果顯示ΔVdThit突變體菌株中丙

6、酮酸代謝中間產(chǎn)物（乙酰輔酶A和乙偶姻）顯著降低，可能是毒力降低和逆境脅迫敏感性增強(qiáng)的重要原因之一。
　　4.通過(guò)補(bǔ)充外界不同濃度的硫胺素，ΔVdThit突變體菌株的形態(tài)特征（菌落直徑、產(chǎn)孢量）與毒力得到部分恢復(fù)。同時(shí)利用qPCR分析ΔVdThit突變體菌株中硫胺素從頭合成途徑基因的表達(dá)，結(jié)果顯示從頭合成途徑中兩個(gè)關(guān)鍵基因（VdSti35和Vdthi11）表達(dá)上調(diào)，且隨著外界硫胺素濃度的升高，兩個(gè)關(guān)鍵基因（VdSti35和Vdthi

7、11）表達(dá)量更高。表明硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的主動(dòng)運(yùn)輸途徑是大麗輪枝菌硫胺素來(lái)源的主要途徑，從頭合成途徑僅是輔助途徑，暗示硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是機(jī)體不可缺少的蛋白因子。
　　5.大麗輪枝菌不同生長(zhǎng)時(shí)期和寄主入侵過(guò)程中硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)模式分析結(jié)果表明，硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在大麗輪枝菌生長(zhǎng)發(fā)育和入侵、定殖過(guò)程中起著不可替代的作用。同時(shí)本研究利用Gateway技術(shù)，構(gòu)建硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的三段靶基因片段的RNAi載體，轉(zhuǎn)化本生煙，分別獲得多個(gè)株系的

8、轉(zhuǎn)大麗輪枝菌硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的靶標(biāo)區(qū)段的本生煙植株，分別命名為 RNAi-VdThit-1、RNAi-VdThit-2、RNAi-VdThit-3。對(duì)獲得靶標(biāo)區(qū)段的本生煙植株進(jìn)行抗病性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：獲得硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白靶標(biāo)基因的本生煙植株對(duì)大麗輪枝菌的抗病性與野生型相比顯著增強(qiáng)，尤其是轉(zhuǎn)化獲得的靶標(biāo)區(qū)段VdThit-1基因片段的本生煙植株的抗病性最強(qiáng)，對(duì)大麗輪枝菌的抗病性表現(xiàn)為高抗等級(jí)。
　　綜上研究結(jié)果表明：本研究獲得大麗輪枝