11830.基于比較基因組學和轉錄組學的枯草芽孢桿菌過量積累核黃素遺傳機理研究

1、基于比較基因組學和轉錄組學的枯草芽比較基因組學和轉錄組學的枯草芽孢桿菌桿菌過量積累過量積累核黃素核黃素遺傳遺傳機理機理研究研究InsightsintogeicacteristicsofriboflavinoverproducingBacillussubtilisbasedoncomparativegenomicstranomics國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目（973計劃）：2011CBA00804；國家自然科學基金項目：NSFC2120

2、6112；國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）：2012AA022103；一級學科：化學工程與技術學科專業(yè)：生物化工研究生：王光路指導教師：趙學明教授天津大學化工學院二零一四年十月中文摘要中文摘要本課題選取核黃素合成基礎菌株為研究對象，通過比較基因組與比較轉錄組分析，篩選出潛在正向突變，進一步利用無痕等位基因置換技術，逆向代謝工程重構突變菌株，考察不同突變對于核黃素合成貢獻度。對鑒定的正向突變進行機理分析，闡述導致枯草芽孢桿菌過量合成核

3、黃素的遺傳機制。轉錄組數(shù)據(jù)表明，和對照菌株相比，B.subtilis24pMX45菌株共有945個差異表達基因，表達水平上調(diào)的基因有483個，表達水平下調(diào)的基因有462個。進一步數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，B.subtilis24pMX45核黃素合成途徑表達水平較高，但嘌呤代謝途徑、一碳單位代謝相關途徑表達水平低。同時，中心碳代謝途徑和葡萄糖轉運系統(tǒng)基因表達水平較低，這些可能是該菌葡萄糖利用速率低、生長速度慢和核黃素合成速率較低的原因。結合全基因組突

4、變分析與比較轉錄組結果，通過無痕等位基因置換技術，鑒定出7個正向突變：RibC（G199D）、ribD（G39A）、PurA（P242L）、CcpN（A44S）、YvrH（R222Q）、YhcF（R90）、YwaA（Q68）。將正向突變以及游離質(zhì)粒pMX45重構至工程菌株BSW54pMX45，可達到B.subtilis24pMX45菌株80%的核黃素合成水平。其中，RibC（G199D）、ribD（G39A）顯著解調(diào)了核黃素操縱子的表達

5、。PurA（P242L）導致了腺苷琥珀酸合成酶活性喪失，導致IMP向AMP合成受阻，菌體過量合成GMPGDPGTP，提高了核黃素合成前體物的供給水平。CcpN（A44S）喪失部分抑制活性，解調(diào)了糖異生代謝途徑，提升了戊糖磷酸途徑的通量和前體物核酮糖5磷酸的供給。雙組分系統(tǒng)轉錄調(diào)節(jié)子基因YvrH（R222Q）突變顯著提升核黃素合成能力。RTPCR實驗表明，受其負調(diào)控lytABC的表達水平明顯上調(diào)，說明YvrH（R222Q）部分丟失功能。轉

6、錄組數(shù)據(jù)表明，LytC（NacetylmuramoylLalanineaase）過表達導致菌株嘌呤合成途徑顯著增強，提高了核黃素合成能力，推測LytC的過表達改變了細胞壁完整性和滲透性，并進一步解調(diào)了嘌呤合成途徑。在谷氨酸棒桿菌工程菌株△4PPC中過表達NacetylmuramoylLalanineaase可顯著提高5氨基乙酰丙酸合成能力，說明這種作用機制對于提高生物基產(chǎn)品的產(chǎn)量可能具有一定普遍適用性。關鍵詞：關鍵詞：枯草芽孢桿菌；核黃