枯草芽孢桿菌核黃素合成途徑相關(guān)基因的修飾.pdf

1、在枯草芽孢桿菌的核黃素合成代謝途徑中，核黃素操縱子（rib）表達(dá)水平與核黃素激酶/FAD合成酶（ribC）活性，是影響核黃素過(guò)量合成的關(guān)鍵因素。本文研究了rib操縱子表達(dá)元件的修飾和mRNA穩(wěn)定子替換的效應(yīng)，以及ribC基因點(diǎn)突變對(duì)核黃素過(guò)量合成的影響。
　　首先采用DNA片段和質(zhì)粒原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，對(duì)B. subtilis24A1菌株的基因重組能力進(jìn)行了檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其在原生質(zhì)體狀態(tài)下沒(méi)有同源重組能力，或者重組率低于4×10-3，不

2、適合作為基因修飾的出發(fā)菌株。
　　以B.subtilisL30為出發(fā)菌，通過(guò)氯霉素抗性基因與rib操縱子啟動(dòng)子區(qū)的雙交換重組，構(gòu)建了核黃素缺陷株B.subtilisLX31，作為rib操縱子表達(dá)元件進(jìn)一步修飾的出發(fā)菌。通過(guò)同源重組方式，分別構(gòu)建了rib操縱子啟動(dòng)子-35區(qū)consensus化修飾，mRNA前導(dǎo)區(qū)被gsiB mRNA穩(wěn)定子替換的重組菌株B. subtilis LX32；以及rib操縱子啟動(dòng)子-35區(qū)consensus

3、化修飾, mRNA前導(dǎo)區(qū)被asnH mNRA穩(wěn)定子替換的重組菌B. subtilis LX33。采用qRT-PCR方法檢測(cè)重組菌胞內(nèi)rib操縱子轉(zhuǎn)錄的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)使用gsiB mRNA穩(wěn)定子修飾的rib操縱子，其mRNA水平相對(duì)出發(fā)菌提高1531倍；使用asnH mNRA穩(wěn)定子修飾的rib操縱子，其mRNA水平相對(duì)出發(fā)菌提高9倍。結(jié)果表明，rib操縱子啟動(dòng)子-35區(qū)consensus化修飾，以及采用gsiB mRNA穩(wěn)定子替換mR

4、NA前導(dǎo)區(qū)，能夠使rib操縱子組成型高表達(dá)。
　　用帶有B.subtilis24A1突變型ribC基因及紅霉素抗性標(biāo)記的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化菌株LX32，在抗性平板上篩選得到了黃色菌落LX34。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)LX34菌株ribC基因的啟動(dòng)子-35區(qū)第一個(gè)堿基發(fā)生了T→C點(diǎn)突變。搖管發(fā)酵顯示, LX34菌株培養(yǎng)36h，核黃素產(chǎn)量達(dá)到2.13g/L，高于24A1菌株1.94g/L的產(chǎn)量，且菌株LX34的生長(zhǎng)能力優(yōu)于24A1。結(jié)果表明，ri