大豆細胞質(zhì)雄性不育系與保持系線粒體DNA的RAPD分子標記.pdf

1、隨著分子生物學的發(fā)展，有關(guān)細胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmicmalestdrility，CMS)機理的研究取得了大量進展。在玉米、矮牽牛、水稻、小麥、油菜、向日葵和菜豆等不育胞質(zhì)的線粒體基因組上已找到了可能與CMS有關(guān)的基因座位。同其它作物相比，大豆CMS的研究進展緩慢。自1993年吉林省農(nóng)科院孫寰等發(fā)現(xiàn)世界上第一個大豆細胞質(zhì)雄性不育系以來，該領(lǐng)域的研究和應用取得了可喜的進展，但是對其分子機理的研究報道尚屬空白。 本實驗以栽

2、培大豆的三對不育系和保持系材料(JLCMS1-1A、JLCMS1-1B、JLCMS1-2A、JLCMS1-2B、JLCMS1-3A、JLCMS1-3B)為研究對象(成對材料間為嚴格的同核異質(zhì)材料)，通過隨機擴增多態(tài)DNA(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)技術(shù)，對大豆不育系與保持系線粒體基因組進行擴增，旨在探討大豆不育系與保持系線粒體基因組間的差異，為大豆細胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的分離鑒定打下基礎(chǔ)，

3、并為揭示大豆細胞質(zhì)雄性不育(CMS)的分子機制提供理論依據(jù)。 對大豆線粒體基因組進行RAPD分析，模板DNA的質(zhì)量要高，即不能含有蛋白質(zhì)或核DNA等的污染。參考其它作物線粒體DNA的提取方法，經(jīng)改進后，所提取的大豆線粒體DNA樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析、OD值測定，結(jié)果表明其得率和純度可以滿足PCR擴增；酶切分析和線粒體特異引物的擴增結(jié)果顯示，線粒體DNA不含有核DNA的污染。 本研究首先建立了穩(wěn)定、高效的RAPD反應體系

4、，然后利用OPERON公司的400個隨機單引物(OPA-OPT系列)和14組雙引物對供試材料進行擴增，大部分引物均有清晰穩(wěn)定的擴增產(chǎn)物。RAPD反應體系具體參數(shù)如下：dNTPs濃度為0.1mmol/L；Taq酶用量為2U；模板DNA濃度為0.4ng/μL；引物濃度為0.8ng/μL。 RAPD分析中，有些特異帶只出現(xiàn)在不育系上，而在保持系相應的位置上沒有。如引物OPE01、OPH07、OPI12、OPK04、OPP17、OPN0

5、3、OPD02和OPD20僅在不育系上出現(xiàn)特異帶。植物的線粒體基因組容易因DNA片段的插入、缺失或重組而引起控制花粉可育功能的基因發(fā)生突變，從而使育性發(fā)生改變。這些特異擴增的片段只出現(xiàn)在不育系上，說明不育系的線粒體基因組可能比保持系的線粒體基因組多出某段序列或發(fā)生了基因重組而引起基因組織結(jié)構(gòu)的改變，并最終引起大豆細胞質(zhì)雄性不育。 相反，有16個引物(OPA12、OPB06、OPD11、OPD18、OPH18、OPI06、OPI0

6、9、OPK07、OPL05、OPL10、OPL13、OPM06、OPP09、OPP15、OPQ13、OPR03)僅在保持系上獲得了一條或多條特異擴增片段，說明不育系的線粒體基因組比保持系的線粒體基因組缺少某段序列使差異產(chǎn)生。這種僅出現(xiàn)在保持系上的特異片段在數(shù)量上要多于出現(xiàn)在不育系上的特異片段數(shù)量?？赡芊从沉碎L期進化過程中，保持系線粒體DNA具有很強的保守性，而不育系線粒體DNA在核質(zhì)互作申容易受到內(nèi)在或外在因素的影響，導致序列發(fā)生變化，

7、進而失去與同一引物較多的結(jié)合機會。菜豆中，與不育相關(guān)的線粒體基因pvs就是在不育系中缺失導致不育產(chǎn)生的。因此，在大豆RAPD分析中出現(xiàn)在保持系上的特異擴增條帶對細胞質(zhì)雄性不育的研究具有重大的價值。 在雙引物擴增中，14組雙引物的RAPD實驗結(jié)果與對應的兩個單引物擴增結(jié)果，只有4組(OPF03/OPF06，OPB20/OPI14，OPG13/OPP17，OPG13/OPD18)是完全一致的，其余10組與原來的單引物擴增結(jié)果均有差異

8、。說明RAPD雙引物擴增揭示出了單引物所檢測不到的多態(tài)性，雙引物擴增實驗可以作為單引物擴增的豐富和補充。 另外，本實驗中所涉及到的在供試材料間存在差異的引物，有一部分(OPA12、OPH18、OPI09、OPH07)在其它作物(油菜、大白菜)不育基因的研究中也存在多態(tài)性標記，這暗示著植物細胞質(zhì)雄性不育在分子基礎(chǔ)上可能存在一些共性。 本研究證明，應用RAPD技術(shù)可以快速、高效地檢測線粒體DNA在不育系和保持系之間的遺傳多態(tài)