大豆不育系及保持系線粒體DNA指紋圖譜的構(gòu)建.pdf

1、植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmicmalesterility，CMS)是植物在有性繁殖過(guò)程中不能產(chǎn)生正?？捎叟渥拥倪z傳現(xiàn)象，這種現(xiàn)象廣泛的存在于開花植物中。1921年首先在亞麻中發(fā)現(xiàn)，目前，在玉米、高粱、水稻、小麥、油菜和向日葵等農(nóng)作物中都發(fā)現(xiàn)了CMS，并在雜種優(yōu)勢(shì)利用中發(fā)揮了巨大作用。 隨著水稻、玉米等主要農(nóng)作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的成功，大豆已成為少數(shù)幾個(gè)沒(méi)有大規(guī)模利用雜種優(yōu)勢(shì)的主要作物之一，其主要原因是沒(méi)有適于雜交種生產(chǎn)

2、的不育系。自從1993年吉林省農(nóng)科院孫寰等發(fā)現(xiàn)世界上第一個(gè)大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系以來(lái)，該領(lǐng)域的研究和應(yīng)用迅速發(fā)展，但是對(duì)不育的分子機(jī)理的研究報(bào)道尚屬空白。 本實(shí)驗(yàn)以栽培大豆的21對(duì)不育系和保持系材料(JLCMS1-1A、JLCMS1-1B、JLCMS1-2A、JLCMS1-2B……JLCMS1-21A、JLCMS1-21B)為研究對(duì)象，通過(guò)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA，RAP

3、D)技術(shù)，對(duì)大豆不育系及保持系的線粒體DNA進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建了大豆不育系及保持系線粒體DNA的指紋圖譜，為大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的分離鑒定打下基礎(chǔ)，并為揭示大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。 主要結(jié)果如下： 1.采用了DNaseⅠ消化法和蔗糖不連續(xù)密度梯度水平超速離心相結(jié)合的方法提取了高質(zhì)量、高純度的大豆線粒體DNA。 2.建立了穩(wěn)定的大豆線粒體DNARAPD擴(kuò)增體系，分別進(jìn)行了模板DNA、d

4、NTPs、TaqDNA聚合酶、引物等的濃度梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(總體積為25μl)，結(jié)果表明最佳的參數(shù)值為：dNTPs濃度為0.1mmol/L；TaqDNA聚合酶用量為2U；模板DNA濃度為0.4ng/μl；引物濃度為0.8ng/μl。最適反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性45s、37℃復(fù)性1min、72℃延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)后，于72℃保溫5min。 3.應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)所選用的21對(duì)大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系

5、及其對(duì)應(yīng)保持系的線粒體DNA進(jìn)行了多態(tài)性標(biāo)記，找到了不育系與保持系線粒體基因組間的差異。通過(guò)對(duì)OPERON公司的380個(gè)隨機(jī)引物的重復(fù)篩選，有24個(gè)引物在兩系間產(chǎn)生穩(wěn)定的擴(kuò)增差異，擴(kuò)增的總譜帶為110條，特異譜帶為84條，每個(gè)引物對(duì)每個(gè)材料的平均擴(kuò)增譜帶為4.58條，平均特異譜帶為3.5條，多態(tài)性比率達(dá)到76.4﹪。說(shuō)明大豆不育系與保持系的線粒體基因組間存在較豐富的遺傳多態(tài)性。這些多態(tài)性片段有的分布在不育系材料上，有的分布在保持系材料上

6、，有的是不育系材料與保持系材料上所共有的，差異片段的存在可能與大豆雄性不育的產(chǎn)生有關(guān)。 4.利用RAPD技術(shù)構(gòu)建了大豆不育系及保持系線粒體DNA的指紋圖譜，采用24個(gè)RAPD引物可將不育系和保持系完全區(qū)分開。該指紋圖譜體現(xiàn)了大豆線粒體DNA上有豐富的多態(tài)性。為大豆品種鑒定、不育系與保持系的劃分、大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的相關(guān)基因的標(biāo)記與分離、品種純度分析、分子輔助育種等方面奠定了理論基礎(chǔ)。 5.首次從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特有的大豆