水稻4種類型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系苗期識(shí)別標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用研究.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球大約一半人口以稻米為主食。過(guò)去30多年的實(shí)踐已經(jīng)證明，雜交水稻是提高單產(chǎn)的成功技術(shù)。我國(guó)是世界上最大的雜交水稻種子生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，具有龐大的雜交水稻種子市場(chǎng)，每年需要雜交水稻種子約40萬(wàn)噸。隨著雜交水稻種植面積的不斷擴(kuò)大，種子需求量增加，加之制種過(guò)程中往往出現(xiàn)機(jī)械混雜、生物學(xué)混雜，及不法經(jīng)營(yíng)者的人為摻雜，導(dǎo)致雜交種的純度和真實(shí)性受到嚴(yán)重影響，造成嚴(yán)重減產(chǎn)。因此，種子純度就成為生產(chǎn)上面臨的一個(gè)突出問題

2、。不育系混雜退化是引起雜交稻混雜退化的主要原因。不育系混雜了保持系，由于后者自交繁殖，不育系中的保持系將可能逐漸增加。用混雜有保持系的不育系制種，雜交一代將出現(xiàn)大量的不育株，影響水稻的雜種優(yōu)勢(shì)。然而，目前種子真實(shí)性和純度鑒定多采用田間種植鑒定，該方法周期長(zhǎng)，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，不能滿足種子市場(chǎng)銷售和品種及時(shí)授權(quán)的需要。為開發(fā)早期能夠穩(wěn)定區(qū)分同核異質(zhì)體的水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系的DNA分子標(biāo)記，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，開展了以下兩個(gè)方面的研究

3、:一是利用秈稻野敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系珍汕97A及其同核保持系珍汕97B為材料，對(duì)RAPD引物OPA12在退火溫度32℃～35℃條件下擴(kuò)增的約1600 bp的DNA片段進(jìn)行酶切、克隆、測(cè)序和TAIL-PCR分析，設(shè)計(jì)開發(fā)穩(wěn)定再現(xiàn)的能夠區(qū)分不育細(xì)胞質(zhì)和可育細(xì)胞質(zhì)的SCAR標(biāo)記。二是以1對(duì)HL型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系，8對(duì)BT型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系，及2個(gè)恢復(fù)系9311和6427 R為材料，利用水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育的特異嵌合基因設(shè)計(jì)開發(fā)的

4、4對(duì)功能性引物，以總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)不育系和保持系苗期識(shí)別標(biāo)記。同時(shí)對(duì)一份人為摻雜的100粒不育系種子批武育粳3A進(jìn)行實(shí)地的驗(yàn)證。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.7種識(shí)別4堿基的限制性內(nèi)切酶(HapⅡ，HaeⅢ，AccⅡ，HhaⅠ，AluⅠ，RsaⅠ，TaqⅠ)酶切OPA12擴(kuò)增珍汕97 A和珍汕97 B的擴(kuò)增產(chǎn)物，沒有檢測(cè)到珍汕97 A和珍汕97 B之間的多態(tài)性。
　　 2

5、.以線粒體DNA為模板，OPA12在珍汕97 A和珍汕97 B中均擴(kuò)增出全長(zhǎng)為1588 bp的條帶，兩者堿基序列完全一樣。
　　 3.以線粒體DNA為模板，SCAR標(biāo)記CHI19F2/CHI19R2在珍汕97 A中能擴(kuò)增出清晰的1588 bp條帶，而在珍汕97 B中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。
　　 4.以線粒體DNA為模板，基于TAIL-PCR結(jié)果設(shè)計(jì)的SCAR標(biāo)記CHI20F3/CHI23R3，在珍汕97A中能擴(kuò)增出預(yù)期的15

6、88 bp的條帶，而在珍汕97B中沒有擴(kuò)增產(chǎn)蝴。
　　 5.組合CHI20F3/CHI23R3與CHI19F2/CHI19R2，以總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，4對(duì)引物組合在珍汕97A中均能擴(kuò)增出1588 bp的特異性條帶，而在珍汕97 B中沒有擴(kuò)增出這條帶。
　　 6.4對(duì)SCAR標(biāo)記在野敗型細(xì)胞質(zhì)秈稻珍品A和珍品B、天豐A和天豐B、印尼水田谷型細(xì)胞質(zhì)秈稻Ⅱ-32A和Ⅱ-32 B、以及汕優(yōu)63的F1和F2單株檢測(cè)中得到

7、驗(yàn)證。
　　 7.用CHI20F3/CHI23R3對(duì)人為混雜的珍汕97A種子批檢測(cè)結(jié)果與表型數(shù)據(jù)完全一致。這些結(jié)果表明CHI20F3/CHI23R3是能夠用于種子或幼苗期鑒別野敗型和印尼水田谷型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系的SCAR標(biāo)記。
　　 8.HL-orf79-1、HL-orf79-2、HL-orf79-3在HL型不育系粵泰A中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出約239 bp的HL型細(xì)胞質(zhì)雄性不育特異性條帶，而在保持系粵泰B、恢復(fù)系9311

8、和6427R中沒有擴(kuò)增出這條特異性條帶。
　　 9.BT-orf79-1在8個(gè)BT型不育系BT型六千辛A、武羌A、863A、武育粳3A、731A、徐2A、9522A、18A中均擴(kuò)增出特異性的239 bp的DNA片段，而在8個(gè)保持系六千辛B、武羌B、863B、武育粳3B、731B、徐2B、9522B、18B沒有這條帶。實(shí)驗(yàn)室對(duì)不育系純度的鑒定結(jié)果與田間表型鑒定的結(jié)果完全一致。因此，來(lái)源于水稻不育細(xì)胞質(zhì)線粒體基因組特有開放閱讀框的2