偽狂犬病毒gC基因“自殺性”DNA疫苗及VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的免疫增強效應(yīng)研究.pdf

1、該研究探討了偽狂犬病毒最主要的保護(hù)性抗原基因gC基因"自殺性"DNA疫苗的免疫原性和保護(hù)效力;研究了偽狂犬病毒VP22的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)特性;比較了4種VP22的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)特性及其增強DNA疫苗免疫反應(yīng)的差異并篩選了增強效果最好的VP22;評價了所篩選的VP22增強不同分子量大小的模式抗原以及PrV gC基因"自殺性"DNA疫苗免疫反應(yīng)的能力.主要研究內(nèi)容如下:1.PrV Ea株gC基因的克隆與序列分析.從PrV Ea株基因組DNA中通過酶切和S

2、outhern雜交克隆了完整的gC基因進(jìn)行了序列測定、糖基化位點和抗原表位預(yù)測、進(jìn)化系統(tǒng)分析與序列比較.2.gC基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)與gC-ELISA方法的建立.以pET-28a為載體,構(gòu)建了gC基因的原核表達(dá)pETC1.5,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得高效表達(dá),表達(dá)蛋白的分子量約為62kDa,主要以包涵體形式存在,Western blot檢測證實具有良好的反應(yīng)原性.3.偽狂犬病毒gC基因"自殺性"DNA疫苗的

3、免疫保護(hù).分別以pcDNA3.1+和pSFV-DNA為載體,構(gòu)建了gC基因的常規(guī)DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒pcDC和"自殺性"DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒pSFVC1.5,轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,Western blot檢測證實兩種表達(dá)質(zhì)粒均能正確表達(dá)gC,而且pSFVC1.5還能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡.4.偽狂犬病毒VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)特性.構(gòu)建了PrV VP22(PVP22)與綠熒光蛋白突變體mut4EGFP融合的真核表達(dá)質(zhì)粒pcPM4,轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞

4、并與mut4EGFP非融合表達(dá)質(zhì)粒(pcM4)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)PVP22-mut4EGFP融合蛋白的熒光呈多種分布,但主要以顆粒的形式分布在核或核外周,也有部分細(xì)胞的熒光呈胞漿分布,而pcM4轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光全部呈彌漫型,分布于整個細(xì)胞.5.與PVP2融合增強mut4EGFP DNA疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫.以pTWIN1為載體,在大腸桿菌中高效表達(dá)了mut4EGFP.采用幾丁質(zhì)親和層析,獲得了高純度的重組mut4EGFP蛋白,可作為ELI

5、SA檢測抗原.將表達(dá)PVP22-mut4EGFP融合蛋白的質(zhì)粒pcPM4免疫小鼠,并與mut4EGFP非融合表達(dá)質(zhì)粒pcM4進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)與PVP22融合表達(dá)能顯著增強mut4EGFP特異性ELISA抗體和CTL活性,而PVP22和mut4EGFP兩種非融合表達(dá)質(zhì)粒的聯(lián)合免疫不能增強免疫反應(yīng),表明免疫反應(yīng)的增強是PVP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的結(jié)果.6.比較4種VP22增強DNA疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫.比較了PrV、BHV-1、HSV-1和M

6、DV-14種VP22的氨基酸同源性,發(fā)現(xiàn)4種VP22近C末端長約80個氨基酸,即:PVP22的149-231AA、BVP22的146-228AA、HVP22的174-256AA、MVP22的92-174AA,呈現(xiàn)高度的同源性,推測是VP22潛在的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域;預(yù)測了4種VP22的空間結(jié)構(gòu).7.BVP22增強模式抗原"自殺性"DNA疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫.構(gòu)建了與BVP22融合的mut4EGFP自殺性"DNA疫苗pSCAM4,體外檢測