2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:初步建立研究信號轉(zhuǎn)導磷蛋白質(zhì)組的方法,并應用此方法初步鑒定幾種作為小鼠肝細胞胰島素信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的組成成分或效應蛋白/酶的磷蛋白,對這些磷蛋白在持續(xù)高濃度的胰島素刺激不同時間點的磷酸化水平進行半定量分析(獲得相對反應速度數(shù)據(jù)),在細胞整體水平觀察細胞內(nèi)的激酶、信號蛋白在胰島素信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)生的動力學變化,以確定信號蛋白、信號途徑之間的相互交流、相互影響、相互作用和相互制約的關(guān)系及其對信號轉(zhuǎn)導最終生理效應的影響;方法:本實驗采用組織

2、塊培養(yǎng)法,原代培養(yǎng)小鼠肝細胞作為實驗材料,32P同位素標記對照組與刺激組小鼠肝細胞磷蛋白,給予刺激組胰島素(100nmol/L)分別作用0min、5min、20min、60min、120min等不同時間長度,液氮終止反應,裂解細胞,收集蛋白,Bio-Rad DC法定量蛋白,根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量的不同采用雙向電泳(一向采用pH3-10的固相pH梯度等電聚焦,二向采用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離所得蛋白,固定凝膠塊后進行干膠,將

3、干好的膠與X膠片一起放入攝影暗匣,在-70oC冰箱中曝光7日,于自動洗片機內(nèi)沖洗X光膠片可得自顯影片,獲得電泳圖譜。采用PDQuest 2D分析軟件分析電泳圖譜中磷蛋白的等電點及分子量,將實驗所得磷蛋白質(zhì)點與Swiss-Prot/TrEMBL蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、PPDB及自建磷蛋白數(shù)據(jù)庫中小鼠肝細胞磷蛋白質(zhì)進行分子量、等電點及磷酸化狀態(tài)的相互比較,初步確定小鼠肝細胞胰島素信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的組成成分或效應蛋白/酶等相關(guān)磷蛋白,采用PDQuest 2

4、D分析軟件分析胰島素刺激不同時間點,蛋白質(zhì)磷酸化水平的變化,并繪制出相應的時間動力學曲線。結(jié)果:初步確定小鼠肝細胞胰島素信號轉(zhuǎn)導相關(guān)磷蛋白有EGFR底物15、信號轉(zhuǎn)導子、熱休克蛋白86、磷脂酰肌醇3激酶α調(diào)節(jié)亞基、蛋白激酶Cα、SHC、蛋白激酶B (PKB)、磷脂酰肌醇3激酶γ調(diào)節(jié)亞基、MAPK 信號整合激酶1、MAPK磷酸酶3、14-3-3蛋白α/β,糖代謝相關(guān)蛋白有糖原合酶底物(Glycogenin-1)等;獲得磷蛋白Shc、PKB

5、、MAPK磷酸酶3、Glycogenin-1、14-3-3α/β等的時間動力學曲線,曲線均呈峰型,其中MAPK磷酸酶3的曲線高峰在5min ,Shc、PKB、Glycogenin-1、14-3-3α/β的曲線高峰在20min。結(jié)論:在細胞整體水平,持續(xù)高濃度的胰島素刺激下,磷蛋白不再表現(xiàn)為在純化體系時呈現(xiàn)的持續(xù)激活狀態(tài),而是激活后很快恢復至低水平磷酸化狀態(tài),表明在細胞整體水平,每個磷蛋白表現(xiàn)的動力學行為是受到整個信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)整合后的動力

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