生長(zhǎng)激素與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子STAT5B對(duì)脂肪細(xì)胞的影響及其與胰島素信號(hào)的Crosstalk.pdf

1、肥胖癥，是機(jī)體代謝異常而導(dǎo)致體內(nèi)脂肪過(guò)度積累的一種慢性疾病，肥胖癥的發(fā)生會(huì)增加心血管疾病、代謝綜合征和2型糖尿病的罹患風(fēng)險(xiǎn)。機(jī)體脂肪細(xì)胞通過(guò)成纖維細(xì)胞樣前體脂肪細(xì)胞分化而來(lái)，前體脂肪細(xì)胞過(guò)度分化或者脂肪細(xì)胞體積增大與肥胖癥的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。
　　生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)，由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌，是分子量為22kDa的單一肽鏈蛋白質(zhì)激素，它是一種多功能的生長(zhǎng)、代謝調(diào)節(jié)激素。GH與其受體二聚體結(jié)合，激活JA

2、K2，引發(fā)一系列信號(hào)通路。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子STAT5是GH下游信號(hào)分子，其兩個(gè)亞型STAT5A及STAT5B分別由不同基因編碼，然而兩者高度同源，可高達(dá)96％。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明:生長(zhǎng)激素受體缺失了STAT5活化的序列可導(dǎo)致動(dòng)物體型變小及肥胖。STAT5B在GH信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，然而其在脂肪分化過(guò)程中的作用及其對(duì)脂肪積累的機(jī)制并不明確，闡明其相應(yīng)機(jī)制可為防治肥胖提供較好的理論基礎(chǔ)，也可為新藥的發(fā)現(xiàn)提供很好的線索。
　　

3、生長(zhǎng)激素與胰島素在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育及代謝中都發(fā)揮重要的作用，在整個(gè)機(jī)體中，這兩種激素協(xié)調(diào)作用以維持機(jī)體代謝的平衡。生長(zhǎng)激素與胰島素的信號(hào)途徑中都有PI3K及ERK兩種通路，而生長(zhǎng)激素還有STAT5途徑。這兩種激素在脂肪細(xì)胞中有什么樣的協(xié)同作用或抑制作用有待于去探索。
　　本課題的工作分以下三部分開(kāi)展:
　　第一部分、生長(zhǎng)激素對(duì)成熟3T3-F442A脂肪細(xì)胞基因表達(dá)的影響研究
　　目的:探討生長(zhǎng)激素對(duì)成熟脂肪細(xì)胞基因表達(dá)的影

4、響
　　研究?jī)?nèi)容:
　　1.誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞3T3-F442A分化成脂肪細(xì)胞，用油紅O染色法鑒定脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的存在，并以異丙醇萃取法對(duì)油紅O著色的甘油三脂在490nm波長(zhǎng)處進(jìn)行定量;
　　2.顯微觀察并收集各分化時(shí)期細(xì)胞樣本。檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中分化標(biāo)志分子（如PPARγ、C/EBPβ、FAS等）的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平;
　　3.對(duì)分化成熟的3T3-F442A脂肪細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)激素干預(yù)(對(duì)照組用

5、PBS)，對(duì)其mRNA進(jìn)行Microarray分析，從而找到差異表達(dá)基因并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證;
　　4.用125 ng/mL的生長(zhǎng)激素劑量對(duì)成熟3T3-F442A脂肪細(xì)胞刺激24 h及48 h（對(duì)照用等體積PBS刺激細(xì)胞），然后檢測(cè)SOCS家族、脂聯(lián)素及其受體mRNA表達(dá)水平;
　　5.用125 ng/mL的生長(zhǎng)激素劑量對(duì)成熟3T3-F442A脂肪細(xì)胞刺激24 h及48 h（對(duì)照用等體積PBS刺激細(xì)胞），運(yùn)用Rea

6、l-Time PCR技術(shù)，檢測(cè)脂肪合成及分解相關(guān)基因的mRNA水平;
　　6.用125 ng/mL的生長(zhǎng)激素劑量干預(yù)3T3-F442A前脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程（對(duì)照用等體積PBS干預(yù)細(xì)胞），于分化不同時(shí)段(0-12天)收集RNA，檢測(cè)脂肪形成標(biāo)志基因、脂肪合成相關(guān)酶類的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.3T3-F442A脂肪前體細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)，細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓，胞漿內(nèi)脂滴出現(xiàn)并逐漸變大增多，油紅O染色逐漸明顯，油紅O染

7、色萃取液的OD490nm值逐漸增大，誘導(dǎo)至第12天后可見(jiàn)90％以上細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型、大量脂滴聚積，確定成功建立脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)模型。
　　2.RT-PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中PPARγmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平隨分化程度的增強(qiáng)逐漸升高，與未分化細(xì)胞（誘導(dǎo)分化第0天）相比較，自誘導(dǎo)分化第4天始，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)皆呈明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。C/EBPβ、FAS基因表達(dá)水平經(jīng)誘導(dǎo)

8、分化顯著升高。
　　3.Microarray分析結(jié)果表明:500 ng/mL生長(zhǎng)激素處理成熟3T3-F442A脂細(xì)胞24 h后Adipor2及SOCS2兩個(gè)基因表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上調(diào)。此結(jié)果為RT-PCR所證實(shí)。
　　4.與對(duì)照組(PBS組)細(xì)胞相比，成熟3T3-F442A脂肪細(xì)胞經(jīng)125 ng/mL生長(zhǎng)激素分別處理24 h及48 h后，IGF-I mRNA表達(dá)水平均上調(diào);生長(zhǎng)激素不改變Leptin的表達(dá);SOCS家族CI

9、S、SOCS1、SOCS3受GH刺激24 h表達(dá)水平均升高，48 h后有所回調(diào);Adiporl在生長(zhǎng)激素刺激24 h時(shí)表達(dá)升高2.5倍;說(shuō)明生長(zhǎng)激素可調(diào)節(jié)成熟3T3-F442A脂肪細(xì)胞內(nèi)一些分子的表達(dá)。
　　5.生長(zhǎng)激素下調(diào)了成熟3T3-F442A脂肪細(xì)胞中FAS、FABP、PPARγ的表達(dá)水平，而不改變C/EBPβ基因的表達(dá);也不改變脂肪分解相關(guān)基因HSL、ATGL、UCP1表達(dá);提示GH影響脂肪細(xì)胞合成活動(dòng)。
　　6.生

10、長(zhǎng)激素對(duì)3T3-F442A前脂細(xì)胞分化過(guò)程的干預(yù)結(jié)果表明:脂肪合成標(biāo)志基因及合成酶類表達(dá)受GH干預(yù)下調(diào)，但GH未能抑制脂肪細(xì)胞的分化，可見(jiàn)GH阻礙脂肪細(xì)胞分化程度但不改變分化進(jìn)程。
　　研究結(jié)論:
　　1.3T3-F442A前體脂肪細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，造模成功。
　　2.Microarray檢測(cè)結(jié)果表明生長(zhǎng)激素在成熟脂肪細(xì)胞可提高SOCS家族及脂聯(lián)素受體的表達(dá)。
　　3.生長(zhǎng)激素在3T3-F442

11、A脂肪前體細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化過(guò)程中，發(fā)揮一定程度的抑制分化的作用，但無(wú)法阻止誘導(dǎo)分化進(jìn)程。
　　第二部分、STAT5B分子在脂肪細(xì)胞分化中的作用研究
　　目的:探討shRNA敲低STAT5B的表達(dá)在前體脂肪細(xì)胞3T3-L1體外分化進(jìn)程中作用。
　　研究?jī)?nèi)容:
　　1.分別檢測(cè)STAT5A及STAT5B在3T3-L1脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中mRNA水平;
　　2.設(shè)計(jì)靶向小鼠STAT5B基因的shRNA序列，

12、構(gòu)建重組慢病毒載體LV3-STAT5B-shRNA，以慢病毒LV3-NC為陰性對(duì)照，經(jīng)293T細(xì)胞包裝病毒后感染脂肪前體細(xì)胞3T3-F442A，篩選出3T3-L1穩(wěn)轉(zhuǎn)STAT5B敲低(Knockdown)的細(xì)胞群(KD)及陰性對(duì)照單細(xì)胞群(NC);
　　3.對(duì)篩選所得穩(wěn)轉(zhuǎn)STAT5BKD細(xì)胞及NC細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，分別于分化不同時(shí)期提取RNA(D0，D2，D4，D6，D8，D10，D12)，檢測(cè)樣本中脂肪分化標(biāo)志基因、脂肪合成相關(guān)

13、酶類及脂分解相關(guān)酶的mRNA水平;
　　4.在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加125 ng/mL劑量的生長(zhǎng)激素以干預(yù)KD及NC兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞群的分化過(guò)程，在分化不同時(shí)段提取RNA，檢測(cè)樣本中脂肪分化標(biāo)志基因、脂肪合成相關(guān)酶類及脂分解相關(guān)酶的mRNA水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中，STAT5A及STAT5B mRNA表達(dá)水平隨細(xì)胞分化程度的增強(qiáng)逐漸升高。與未分化前(D0)比較，3T3-L1前脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化第2天S

14、TAT5B基因表達(dá)即明顯升高，且分化過(guò)程中穩(wěn)定表達(dá)。
　　2.對(duì)篩選出的STAT5BKD及NC3T3-L1脂肪前體單克隆細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR和Western Blot檢測(cè)，結(jié)果表明所選STAT5B-shRNA序列能夠有效干擾STAT5BmRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，分別降低至30％及10％。
　　3.體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:干擾STAT5B表達(dá)降低了脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá);與分化同期對(duì)照組細(xì)胞(NC)比較，敲低STAT5B表

15、達(dá)組細(xì)胞(KD)在誘導(dǎo)分化過(guò)程中PPARα、PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ等mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(p＜0.05）。
　　4.體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明:與對(duì)照(NC)細(xì)胞比較，KD細(xì)胞脂肪合成相關(guān)酶類，如脂肪酸合成酶(FAS)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)的表達(dá)水平下降。乙酰輔酶A羧化酶(ACC)表達(dá)兩組無(wú)明顯差異。
　　5.生長(zhǎng)激素干預(yù)降低了KD及NC兩組細(xì)胞脂肪合成關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子及脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)水平，但

16、GH干預(yù)對(duì)NC組的蛋白表達(dá)所致之降低更為明顯。
　　6.生長(zhǎng)激素干預(yù)在3T3-L1前脂細(xì)胞分化中上調(diào)了ATGL的表達(dá);生長(zhǎng)激素作用大幅上調(diào)了NC細(xì)胞中UCP1的表達(dá)，而未改變KD細(xì)胞中UCP1的表達(dá)。
　　研究結(jié)論:
　　1.在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的體外分化過(guò)程中，STAT5B呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。
　　2.敲低3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中STAT5B基因的表達(dá)，其分化過(guò)程中關(guān)鍵性酶及分子的表達(dá)水平受到影響。
　

17、　3.在前脂細(xì)胞分化過(guò)程中，因生長(zhǎng)激素的干預(yù)作用使PPARα、PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、FAS及FABP六種與脂肪形成相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)。
　　4.在前脂細(xì)胞分化過(guò)程中，因生長(zhǎng)激素的干預(yù)作用使得ATGL基因的表達(dá)上調(diào)，也使UCP1基因的表達(dá)大幅上調(diào)，這種上調(diào)在STAT5B敲低的細(xì)胞中未得到體現(xiàn)，提示這種表達(dá)上調(diào)是STAT5B依賴性的。
　　第三部分、胰島素/IGF-I對(duì)生長(zhǎng)激素STAT5信號(hào)通路的影響研究

18、>　　目的:探討胰島素對(duì)生長(zhǎng)激素在成熟3T3-F442A脂肪細(xì)胞中信號(hào)通路的影響
　　研究?jī)?nèi)容:
　　1.以系列濃度(0、5、25、50、125 ng/mL)生長(zhǎng)激素刺激3T3-F442A成熟脂肪細(xì)胞，檢測(cè)STAT5及MAPK信號(hào)的磷酸化程度;
　　2.以200 nM胰島素及100 ng/mL IGF-I刺激3T3-F442A成熟脂肪細(xì)胞模型，運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)STAT5及MAPK信號(hào)通路的活化程度;

19、
　　3.用胰島素與系列濃度生長(zhǎng)激素共同作用脂肪細(xì)胞10 min及胰島素預(yù)處理20min后再與系列濃度生長(zhǎng)激素共同作用10 min，檢測(cè)胰島素對(duì)生長(zhǎng)激素信號(hào)通路分子STAT5及MAPK磷酸化影響;
　　4.用IGF-I與生長(zhǎng)激素共同作用分化成熟的脂肪細(xì)胞10 min及IGF-I預(yù)處理20min后再與生長(zhǎng)激素共同作用10 min，檢測(cè)信號(hào)通路分子STAT5及MAPK磷酸化變化;
　　5.在C57/BL6小鼠腹腔體內(nèi)注射生

20、長(zhǎng)激素及胰島素，取腎周脂肪組織提取蛋白質(zhì)，檢測(cè)動(dòng)物脂肪中胰島素對(duì)生長(zhǎng)激素信號(hào)分子STAT5及MAPK活化的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.在成熟3T3-F442A脂肪細(xì)胞中，生長(zhǎng)激素誘導(dǎo)STAT5磷酸化水平及MAPK磷酸化水平與生長(zhǎng)激素均呈劑量及作用時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。
　　2.胰島素或IGF-I刺激3T3-F442A脂肪細(xì)胞不誘導(dǎo)STAT5酪氨酸磷酸化;但可誘導(dǎo)MAPK的酪氨酸磷酸化。
　　3.細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明:

21、胰島素可增強(qiáng)生長(zhǎng)激素誘導(dǎo)的STAT5磷酸化水平，提示胰島素與生長(zhǎng)激素共同作用可提高生長(zhǎng)激素對(duì)STAT5活化的程度。
　　4.IGF-I也可增強(qiáng)生長(zhǎng)激素誘導(dǎo)STAT5磷酸化水平，提示IGF-I有與胰島素類似的效應(yīng)，即與生長(zhǎng)激素共同作用而促進(jìn)了STAT5的活化水平。
　　研究結(jié)論:
　　1.生長(zhǎng)激素特異性活化3T3-F442A成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT5信號(hào)通路，而胰島素及IGF-I不引起此通路的活化;
　　2.

22、細(xì)胞及動(dòng)物試驗(yàn)均表明:胰島素增強(qiáng)了生長(zhǎng)激素活化STAT5的程度，提示胰島素與生長(zhǎng)激素可能在成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)協(xié)同調(diào)節(jié)特定的生理功能。
　　3.IGF-I與胰島素有相近的信號(hào)通路，本課題發(fā)現(xiàn)IGF-I也可增強(qiáng)生長(zhǎng)激素對(duì)STAT5信號(hào)通路的活化程度。
　　4.生長(zhǎng)激素的STAT5途徑有利于抑制脂肪的積累，而胰島素則有利于前脂肪細(xì)胞的分化、脂肪的積累。我們的觀察表明，胰島素與生長(zhǎng)激素共同存在時(shí)，可促進(jìn)生長(zhǎng)激素引發(fā)的STAT5途徑，這可