針對(duì)Hh信號(hào)通路的人惡性膠質(zhì)瘤靶向治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)惡性腫瘤，其中病理分級(jí)為WHOⅢ-Ⅳ級(jí)的惡性膠質(zhì)瘤，病情進(jìn)展迅速，復(fù)發(fā)快，預(yù)后差。目前手術(shù)結(jié)合放、化療的綜合治療是經(jīng)典的治療方法，但對(duì)于惡性膠質(zhì)瘤患者的總體預(yù)后改善有限，主要原因在于難以避免的腫瘤復(fù)發(fā)。惡性膠質(zhì)瘤的化療是重要的輔助治療手段，然而由于傳統(tǒng)化療藥物的非特異性、細(xì)胞毒性和腫瘤本身的耐藥性使得該類(lèi)藥物的總體療效欠佳。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展與特定信號(hào)通路的異常激活密切相關(guān)，因此以細(xì)

2、胞特定受體、關(guān)鍵基因和調(diào)控分子為靶點(diǎn)的輔助治療具有良好的應(yīng)用前景。
　　 腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞中僅有一小部分細(xì)胞具有自我更新、無(wú)限增殖、多向分化潛能的干細(xì)胞樣特性，它們是腫瘤發(fā)生，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中也存在著這樣一類(lèi)以CD133陽(yáng)性作為標(biāo)記的腦腫瘤干細(xì)胞(BTSCs)，并且證明其具有高度的耐藥性、抗凋亡能力以及侵襲能力。這些腫瘤干細(xì)胞應(yīng)該是今后惡性膠質(zhì)瘤靶向治療的主要研究方向。目前認(rèn)為腦腫瘤干細(xì)胞可能起源于

3、發(fā)生基因突變的正常神經(jīng)干細(xì)胞，因而一些負(fù)責(zé)調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞自我更新、分化、增殖的關(guān)鍵信號(hào)通路，如Hh、Wnt、Notch信號(hào)通路等，可能在腦腫瘤干細(xì)胞中起著重要的作用。其中Hh通路是目前腫瘤干細(xì)胞相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。已有的研究表明：Hh通路既對(duì)內(nèi)源性干細(xì)胞的增殖起調(diào)節(jié)作用，也可能對(duì)腫瘤干細(xì)胞起調(diào)節(jié)作用，其異常激活能導(dǎo)致多種腫瘤生成，如基底細(xì)胞癌、髓母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、胰腺癌等；目前體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中對(duì)該通路的特異性阻斷對(duì)這些腫瘤的治療均取得了

4、一定的效果，但其中的具體作用機(jī)制還沒(méi)有完全闡明。因此對(duì)該信號(hào)通路的繼續(xù)探索也成為了目前相關(guān)腫瘤基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的前沿。
　　 目前針對(duì)Hh通路應(yīng)用較多的一類(lèi)阻滯劑為環(huán)杷明（cyclopamine），其能夠結(jié)合Smo受體從而抑制Hh信號(hào)通路活性。已有的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明cyclopamine對(duì)包括部分膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種Hh通路相關(guān)性腫瘤有效。然而cyclopamine類(lèi)抑制劑只能對(duì)由Hh信號(hào)通路上游基因變化導(dǎo)致異?；罨哪[瘤有作用，而對(duì)由S

5、mo級(jí)聯(lián)反應(yīng)以下的參與Hh信號(hào)通路調(diào)控的分子變化，如sufu基因突變所導(dǎo)致的腫瘤沒(méi)有治療效果。因此，進(jìn)一步尋找Hh通路下游阻滯劑，如Gli轉(zhuǎn)錄因子阻滯劑，對(duì)于Hh通路相關(guān)性膠質(zhì)瘤的干預(yù)治療具有重要意義。
　　 方法：
　　 第一部分：通過(guò)rt-PCR和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Hh通路的主要基因Glil在不同的原代細(xì)胞及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)；分別利用real-time PCR、western blot驗(yàn)證GANT61對(duì)Hh通

6、路異常激活的膠質(zhì)瘤Glil mRNA和Ptchl蛋白的調(diào)控作用；利用MTS試驗(yàn)，驗(yàn)證GANT61對(duì)不同株膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性的影響，并根據(jù)此項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果得出的時(shí)間?劑量?活性相關(guān)曲線(xiàn)確定該藥物的有效濃度；進(jìn)而借助于PI染色法檢測(cè)GANT61對(duì)細(xì)胞周期的影響，并以Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 第二部分：利用免疫磁珠分選技術(shù)( MACS)在U87細(xì)胞系中分選得到CD133陽(yáng)性的腦腫瘤干細(xì)胞，并通過(guò)單克隆形成試驗(yàn)、免疫

7、熒光標(biāo)記和裸鼠致瘤試驗(yàn)鑒定其干細(xì)胞樣生物學(xué)特性；然后予以GANT61體外作用相應(yīng)時(shí)間后再次檢測(cè)腦腫瘤干細(xì)胞自我更新能力、干細(xì)胞特異性標(biāo)記的維持以及裸鼠致瘤能力的變化。
　　 第三部分：通過(guò)裸鼠皮下接種法構(gòu)建膠質(zhì)瘤的種植瘤模型，按療程瘤周注射GANT61后定期測(cè)量腫瘤體積變化；收集處理組與對(duì)照組新鮮腫瘤組織以PCR和免疫組化技術(shù)分別檢測(cè)Ptchl mRNA和蛋白水平的變化；以TUNEL法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，以BRDU染色法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的

8、增殖。另取GANT61干預(yù)后的腫瘤組織體外再培養(yǎng)并檢測(cè)其自我更新能力和體內(nèi)致瘤能力。
　　 結(jié)果：
　　 1.在7例惡性膠質(zhì)瘤樣本中3例為WHO III級(jí)，4例為WHO IV級(jí)。其中2/5原代腫瘤細(xì)胞和1/2腫瘤細(xì)胞系的Glil高表達(dá)。但Glil的表達(dá)情況與病理分級(jí)沒(méi)有明確的相關(guān)性。
　　 2.5μM濃度的GANT61能夠在體外實(shí)驗(yàn)中時(shí)間依賴(lài)的阻斷Glil轉(zhuǎn)錄活性，3個(gè)樣本作用48h后Glil mRNA均得到明顯

9、下調(diào)，作為Glil下游靶基因之一的Ptchl的蛋白表達(dá)也較對(duì)照組下降，說(shuō)明GANT61能通過(guò)抑制Glil轉(zhuǎn)錄活性來(lái)阻斷其下游的信號(hào)傳導(dǎo)。
　　 3.GANT61對(duì)于Glil表達(dá)異常增高的惡性膠質(zhì)瘤具有時(shí)間和劑量依賴(lài)的細(xì)胞活性抑制作用，作用48h可以達(dá)到最大抑制效果，其IC50為10μM。
　　 4.10μM的GANT61作用48h可以明顯增加G1亞峰和G0/G1期的細(xì)胞比例，這提示GANT61主要通過(guò)誘導(dǎo)G1/S期的周期

10、阻滯和增加細(xì)胞死亡來(lái)減慢膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。
　　 5.10μM的GANT61作用48h可以通過(guò)降低Glil轉(zhuǎn)錄活性而增加早期凋亡細(xì)胞比例。
　　 6.通過(guò)MACS技術(shù)從U87細(xì)胞系中分選出CD133陽(yáng)性的細(xì)胞亞群。經(jīng)驗(yàn)證分選所得的CD133陽(yáng)性細(xì)胞具有自我更新、多向分化潛能和體內(nèi)致瘤能力，具有腦腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(BTSCs)的典型特征。
　　 7.CD133陽(yáng)性組膠質(zhì)瘤細(xì)胞Gill mRNA水平較陰性組明顯增高。1

11、0μMGANT61作用48h后能明顯抑制BTSCs Glil轉(zhuǎn)錄活性。
　　 8.10μM GANT61共培養(yǎng)2天或20μM GANT61共培養(yǎng)7天都不能明顯增加BTSCs早期凋亡，這提示在BTSCs中Hh通路可能并不是唯一調(diào)控其抗凋亡能力的信號(hào)通路。
　　 9.CD133陽(yáng)性細(xì)胞與10μ M GANT61共培養(yǎng)7天后，其腫瘤球樣克隆形成能力明顯減弱，CD133陽(yáng)性率明顯下降，將其接種至裸鼠皮下后未能致瘤。這提示GANT

12、61對(duì)BTSCs的體外作用能降低其自我更新能力。
　　 10.用濃度5mg/ml、劑量20mg/kg的GANT61對(duì)皮下荷瘤裸鼠作隔天瘤周注射，2周后處理組種植瘤體積較對(duì)照組明顯小。
　　 11.對(duì)照組瘤體中Ptchl呈高表達(dá)，而在治療組經(jīng)過(guò)2周GANT61局部皮下注射后瘤體的Ptchl在mRNA和蛋白水平均明顯下降。
　　 12.在體內(nèi)環(huán)境下GANT61能提高腫瘤的TUNEL陽(yáng)性率并降低BRDU標(biāo)記的的陽(yáng)性率，

13、提示其能增加腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制增殖。
　　 13.處理組種植瘤消化后經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)仍能形成腫瘤球樣克隆，并具有裸鼠致瘤能力。這提示在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)使用GANT61不能完全消滅腫瘤干細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 1.在惡性膠質(zhì)瘤中存在Hh通路活性異常增高的亞型，以Glil mRNA的高表達(dá)為主要表現(xiàn)。但Glil的表達(dá)情況與病理分級(jí)沒(méi)有明確的相關(guān)性。
　　 2.在體外實(shí)驗(yàn)中GANT61能通過(guò)抑制Glil轉(zhuǎn)錄來(lái)降