日本血吸蟲性別差異蛋白質組及抱雌溝蛋白基因功能研究.pdf

1、本論文針對此特點開展了日本血吸蟲性別差異蛋白質組和雄蟲特異性表達的抱雌溝蛋白基因的功能研究，以探索血吸蟲雌雄蟲合抱、發(fā)育成熟的分子機理，開拓免疫預防新途徑。 一、關于日本血吸蟲性別差異蛋白質組研究。本研究利用蛋白質組學技術首次對日本血吸蟲蟲卵、童蟲(14天)、成熟雌蟲和成熟雄蟲的可溶性蛋白、疏水性蛋白和膜蛋白進行了系統(tǒng)分離，構建了各自的高分辨率雙向電泳圖譜。表明蟲卵、童蟲、成熟雌蟲和成熟雄蟲在可溶性蛋白組份分別分離到1016±6

2、7，1808±89，1142±45和1288±32個蛋白斑點；在疏水性蛋白組份分別分離到1425±108，952±59，847±75和965±69個蛋白斑點；在膜蛋白組份分別分離到78±3、67±3、108±4和122±4個蛋白斑點。比較分析獲得合抱后雌雄成蟲特異呈現的性別差異蛋白質譜，雌雄成蟲分別獨特呈現23±2和41±4個可溶性蛋白斑點；26±3和¨±1個疏水性蛋白斑點；4和5個膜蛋白斑點。鑒定了28個合抱后雌雄成蟲特異呈現的蛋白。

3、結果提示參與細胞間信息傳遞的信號分子、參與基因轉錄和蛋白翻譯調控分子和參與代謝酶類、發(fā)育調節(jié)因子等在合抱后雌雄蟲呈現表達差異。本研究為深入揭示雌雄蟲合抱后蟲體的發(fā)育、雌蟲成熟產卵的機制提供了分子基礎，對開發(fā)新的疫苗候選抗原和藥物靶標具有重要價值。 二、關于日本血吸蟲抱雌溝蛋白基因的功能研究。抱雌溝蛋白為血吸蟲雄蟲特異性表達，在與其合抱的雌蟲體表廣泛分布一種性別特異性蛋白。本論文利用RNA干擾技術對抱雌溝蛋白基因的功能進行了研究。

4、根據日本血吸蟲抱雌溝蛋白基因序列設計3對dsRNA分子(s1，s2，s3)并分別按低和高濃度(50nM和200nM)加入培養(yǎng)體系以干擾抱雌溝蛋白基因的表達。利用RT-PCR、Westernblotting和免疫熒光分析證明能顯著抑制抱雌溝蛋白基因的轉錄，可高達84％。又分析了dsRNA分子干擾的劑量效應，結果表明dsRNA分子(s1)抑制抱雌溝蛋白基因具有劑量依賴性，當dsRNA分子終濃度為100nM作用7天時，抱雌溝蛋白基因的轉錄水平

5、降低75％。對蟲體雌雄蟲合抱效應的觀察表明，干擾后雌雄合抱受到不同程度的影響，其中兩個高濃度干擾組(s1，s2)的合抱現象完全受到抑制。利用掃描電子顯微鏡分析合抱完全受到抑制的雄蟲抱雌溝表膜結構，與對照組相比其結構呈現瘠的間斷，瘠間隙大和刺短的變化。進一步利用cDNA微陣列對干擾抱雌溝蛋白基因后引起的蟲體相關基因表達變化進行了初步探索，結果顯示參與信號轉導和轉錄調控因子功能的基因呈現表達下調，參與膜轉運、能量和離子代謝及應激蛋白等基因呈

6、現表達上調。通過上述研究發(fā)現抱雌溝蛋白基因具有影響血吸蟲雌雄蟲合抱功能，本論文結果也是國內外首次明確某種物質能影響雌雄蟲的合抱，對于開拓抗血吸蟲生殖發(fā)育新途徑的理論基礎和實踐應用具有重要意義。采用尾靜脈動態(tài)注射技術將dsRNA分子導入到血吸蟲感染的小鼠體內。結果表明在動物體內血吸蟲抱雌溝蛋白基因的轉錄和表達明顯降低，雌雄蟲的合抱受到顯著抑制。據作者查詢所知，這是在動物個體水平上實現利用RNAi技術成功干擾血吸蟲基因功能的首例，揭示了基因