辛伐他汀改善APP轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能及體外對(duì)抗Aβ?lián)p傷的線粒體機(jī)制.pdf

1、目的:研究辛伐他汀(simvastatin，SV)對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能的改善作用和對(duì)β淀粉樣多肽（amyloid-β peptide，Aβ）損傷SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討其線粒體機(jī)制，為辛伐他汀應(yīng)用于AD的防治提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:在體實(shí)驗(yàn):選用3月齡的野生型(WT)和APP轉(zhuǎn)基因小鼠，對(duì)其進(jìn)行分組:野生型小鼠組(WT)、APP轉(zhuǎn)基因小鼠組(APP)、給予辛伐他汀的野生型小鼠組(WT(SV))、給

2、予辛伐他汀的APP轉(zhuǎn)基因小鼠組(APP(SV))，然后持續(xù)給予辛伐他汀3個(gè)月，到6月齡時(shí)采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)記憶能力。之后部分小鼠用4％的多聚甲醛心臟灌流，取腦后固定過(guò)夜，冰凍切片機(jī)切片（25μm厚度），Thioflavin-S染色法檢測(cè)Aβ斑塊的沉積情況，免疫組化法檢測(cè)SOD2的表達(dá)情況;另一部分小鼠被斷頭取腦，分離皮層和海馬組織，提取小鼠皮層和海馬組織的線粒體，采用H2DCF-DA熒光探針?lè)z測(cè)ROS的含量，JC-1

3、染色法檢測(cè)線粒體膜電位，熒光素酶法檢測(cè)ATP含量，Ca2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹檢測(cè)線粒體腫脹度，Western blot法檢測(cè)Aβ、SOD2、Bcl-2、Bax、PGC-1α的表達(dá)水平;另外用透射電子顯微鏡觀察小鼠海馬CA1區(qū)線粒體和突觸的超微結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　離體實(shí)驗(yàn):以不同濃度(1、10、100 nmol/L)的辛伐他汀預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞24h，再加入Aβ1-42(10μmol/L)處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。采用M

4、TT法檢測(cè)細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀和Hoechst33342染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，JC-1染色法檢測(cè)線粒體膜電位，熒光素酶法檢測(cè)細(xì)胞中ATP含量，Clark氧電極法檢測(cè)細(xì)胞的呼吸功能，MitoTracker Red染色法檢測(cè)線粒體數(shù)量，DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞中ROS的含量，Western blot法檢測(cè)Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3、cyt C、核受體過(guò)氧化酶體-增殖子激活受體Y共激活因子1α(PGC-1α)的

5、表達(dá)水平。
　　結(jié)果:Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果顯示，APP組小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)、在目標(biāo)象限所停留的時(shí)間顯著減少，而給予辛伐他汀的APP組小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間顯著性縮短、在目標(biāo)象限所停留的時(shí)間顯著增加，且各組小鼠游泳速度無(wú)明顯差異，這表明給予辛伐他汀能明顯改善APP小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。但辛伐他汀對(duì)小鼠腦中Aβ斑塊的沉積和線粒體中Aβ蛋白的水平無(wú)影響;且6月齡的APP轉(zhuǎn)基因小鼠未見(jiàn)明顯氧化損傷;APP轉(zhuǎn)基因小鼠與WT小鼠相比，

6、線粒體的膜電位、ATP含量未見(jiàn)明顯改變，Ca2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹度結(jié)果也無(wú)顯著性差異，Bcl-2、Bax、PGC-1α的表達(dá)也未見(jiàn)明顯改變;小鼠海馬CA1區(qū)線粒體和突觸超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果顯示，APP組小鼠線粒體體積增大，線粒體數(shù)目不變，突觸數(shù)量減少，而辛伐他汀對(duì)APP小鼠海馬CA1區(qū)線粒體和突觸的改變無(wú)明顯影響。
　　MTT結(jié)果表明10μmol/L Aβ1-42對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞有損傷作用，10、100 nmol/L的辛伐他汀對(duì)A

7、β1-42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，能對(duì)抗Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制線粒體膜電位的降低、ATP含量的減少、耗氧量的減少、ROS含量的增加，增加線粒體數(shù)目，促進(jìn)Bcl-2、PGC-1α的表達(dá)，抑制Bax、cleaved-caspase3的表達(dá)，抑制cytC的釋放。
　　結(jié)論:辛伐他汀能改善APP轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能，它對(duì)APP小鼠腦中Aβ無(wú)明顯影響。6月齡的APP小鼠未見(jiàn)明顯氧化損傷，且皮層和海馬線粒體功能未見(jiàn)