鈣調素抑制劑對血管性癡呆小鼠認知功能損傷的改善作用及機制研究.pdf

1、背景:隨著社會人口老齡化和腦血管病發(fā)病率升高，認知障礙的患病率和致殘率快速上升，65～85歲人群中認知障礙的發(fā)生率為25％，85歲以上可高達65％。血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由多種復雜腦血管危險因素造成，是伴有認智能損害和知功能障礙的慢性退行性疾病，具有獲得性和持續(xù)性的特點。VD是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的可導致認知功能障礙第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給個人、家庭和公共醫(yī)療

2、體系造成了沉重的經(jīng)濟負擔。頸動脈狹窄導致腦血流供應不足等腦血管危險因素均與VD認知功能障礙關系密切。慢性腦血流低灌注導致的腦白質損傷和認知功能障礙在老年人中非常普遍，嚴重影響其生活質量。由于缺乏明確的分子機制和藥物靶點，臨床治療VD多采用促進膽堿能系統(tǒng)功能的藥物及改善腦代謝藥物等進行對癥治療，但這些藥物能否延緩大腦功能全面衰退或逆轉癡呆病程還有待長期隨訪觀察。由此，對癡呆的防治仍是今后醫(yī)藥研究領域面臨的嚴峻挑戰(zhàn)，亟需對血管性癡呆的機制進

3、行深入研究，探尋發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標。
　　VD的發(fā)病機制是國際上神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究熱點之一。慢性腦血流低灌注導致腦葡萄糖和氧氣供應長期不足，最終可造成海馬部位神經(jīng)元病理生理改變，如膜磷脂代謝障礙、氧自由基過多生成、過量興奮性氨基酸釋放、細胞內鈣超載等，這些因素作用的綜合結果是導致該部位膽堿能神經(jīng)元損害，星膠質細胞肥大和增生，小膠質細胞激活，伴有腦白質病理性損傷，由此患者最終出現(xiàn)認知功能障礙。VD患者人群由于病因的多樣性和病程放的不同，

4、導致抽樣可控性差，其病理生理機制不同，建立統(tǒng)一的臨床病例納入和排除標準不容易。于此相關，如何建立能盡可能模擬VD患者病理過程的動物疾病模型也是需要考慮的重要問題。原有VD動物模型類型龐雜，各自僅模仿VD單方面發(fā)病及病生特點，不能較為全面反映VD的特征。近年來，隨著分子生物學技術的應用，VD疾病的分子機理有新的揭示，加之轉基因模式動物在研究中突出的優(yōu)勢，故探索一種可使頸動脈狹窄引起長期慢性腦血流低灌注小鼠模型，對將來從分子水平認識VD發(fā)病

5、機理和開展新藥研究尤為關鍵。
　　鈣調蛋白(Calmodulin，CaM)可以激活多種酶或者通道，在神經(jīng)系統(tǒng)中參與調節(jié)神經(jīng)元的代謝、軸漿運輸、突觸功能以及遞質的合成與釋放等。大量研究表明，Ca2+/CaM信號紊亂是介導腦缺血病理進程的重要因素，參與異常激活Ca2+依賴蛋白激酶如磷脂酶A2和鈣蛋白酶Calpain，以及Ca2+/CaM依賴酶一氧化氮合酶(NOS)和鈣調磷酸酶(calcineurin，CaN)。而磷脂酶A2激活可激發(fā)一

6、系列病理過程，比如引起花生四烯酸(arachidonic acid，AA)堆積，從而導致AA在環(huán)氧酶及脂氧酶作用下生成前列腺素、白三烯和自由基等活性物質，進而破壞生物膜而引發(fā)廣泛的炎癥反應。其中炎性細胞分泌大量促炎細胞因子如白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α(tumoral necrosis factor-α，TNF-α)和Fas配體(Fas ligand)，從而引起DNA、蛋白質和磷脂降解，

7、引發(fā)缺血性腦損傷。前期發(fā)現(xiàn)針對上述Ca2+/CaM依存的信號通路進行藥物調控也可有效保護急性神經(jīng)血管單元損傷。雖然CaM抑制劑在缺血性腦血管病的防治研究中顯示了其藥理作用，但其是否可減緩或控制VD癥狀及病理過程還未見報道。
　　在上述背景下，本實驗將通過選擇合適的VD病理模型，探索Ca2+/CaM抑制劑對VD癥狀及病理過程的干預作用及潛在機制。DY98，3-{2-[4N-（2-甲基-3-氯苯基）-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲

8、氧基-1H-吲唑草酸鹽是DY9760e的衍生物，屬于吲唑化合物，一個用于治療急性腦缺血藥物，尚未市售。DY98作為鈣調素抑制劑，化學結構和藥效學作用類似DY9760e。有報道DY9760e可保護微栓塞導致的血腦屏障損害，減輕腦水腫，是一種有效的抗急性腦缺血損傷保護劑。故本研究探索DY98其是否具有治療VD認知障礙的藥理學作用。此外，多聚唾液酸(polysialic acid，PSA)是一種位于細胞表面的，由α-2，8神經(jīng)氨酸組成的線性的

9、、均一多聚的碳水化合物，神經(jīng)細胞黏附因子(NCAM)是多聚唾液酸的主要載體。PSA作為一種親水的、無毒和生物可降解的內源性聚合物，在藥物載體中也得到了較為廣泛的應用。聚合物膠束具有穿透血腦屏障(BBB)的能力。因此基于聚合物膠束的納米藥物傳遞系統(tǒng)，有望提高治療VD藥物的療效，本研究中采用PSA和DY98聯(lián)合給藥也是基于上述目的。
　　本論文主要研究內容框架如下:
　　1)本研究首先參照文獻，建立及優(yōu)化小鼠長期慢性腦血流低灌注

10、血管性癡呆模型。在手術30d后，采用Morris水迷宮評價學習記憶功能。另采用轉輪法、曠場實驗、高架十字迷宮實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗，對模型小鼠進行運動關聯(lián)、焦慮和抑郁功能相關的行為學評價。
　　2)合成十八胺修飾聚唾液酸(PSA-ODA)，制備載DY98PSA-ODA膠束，并對其化學特性進行表征。
　　3)采用鈣調素抑制劑及其PSA膠束，研究對VD的治療作用及可能機制。鈣調素抑制劑DY98(1mg/kg)及其PSA膠束

11、PSA+DY98(7+0.25)mg/kg體重分別灌胃和腹腔注射給藥治療1月后，以Morris水迷宮等方法觀察DY98及其PSA膠束對慢性腦缺血致認知損害的改善作用。
　　通過以上實驗研究，取得主要研究結果如下:
　　一、血管性癡呆小鼠模型優(yōu)化
　　1)小鼠雙側動脈血流阻斷及合并硝普鈉法，模型小鼠手術前后2h內局部腦血流于對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。術后14-18d和28-32d Morris水迷宮空間記憶功能無損害

12、，提示該模型不成功。
　　2)雙側頸動脈血流阻斷20分鐘3次，術后7d Morris水迷宮空間記憶功能損害，死亡率很高。雙側頸動脈血流阻斷20分鐘2次，術后28d Morris水迷宮空間記憶功能損害，死亡率仍高。雙側頸動脈血流阻斷10分鐘2次，術后28d Morris水迷宮空間記憶功能無損害。
　　二、PSA-DY98包和物的合成及特性表征分析
　　1)合成的PSA-ODA聚合物具有兩親性特征，當PSA-ODA在水溶液

13、中的濃度高于120μg/mL，可形成聚合物膠束的空間結構?？瞻啄z束的粒徑在水相中為145.7±2.08nm，且具有狹窄的粒徑分布。透射電子顯微鏡觀察到的PSA-ODA空白膠束的粒徑在50nm左右。PSA的羧基基團的zeta電位為-33.4±2.56mV。ODA修飾后，PSA-ODA膠束的zeta電勢下降到-21.2±1.01mV，膠束表面較高的zeta電位，增加聚合物膠束的穩(wěn)定性。
　　2)DY98從載藥膠束中的體外釋放具有緩釋特

14、征。
　　三、鈣調素抑制劑DY98及其PSA包和物對VD小鼠的治療作用及機制研究
　　采用DY98和其PSA包和物對慢性腦血流低灌注血管性癡呆小鼠藥效學評價及海馬腦區(qū)硝化應激、炎癥等相關信號分子機制的探索。主要結果如下:1)藥效學研究:與模型對照組小鼠相比，Morris水迷宮空間探索試驗中，DY98(1mg/Kg)高劑量處理組、DY98(0.5mg/Kg)低劑量處理組、PSA(7mg/Kg)處理組、PSA+DY98(0.25

15、mg/Kg)處理組上臺潛伏期均減少;定位航行試驗中，DY98(1mg/Kg)高劑量處理組、PSA(7mg/Kg)處理組上臺潛伏期均減少;工作記憶試驗中，DY98(1mg/Kg)高劑量處理組、PSA(7mg/Kg)處理組、PSA+DY98(0.25mg/Kg)處理組上臺潛伏期均減少。
　　結論:
　　1)以水迷宮等作為認知功能障礙行為學評價指標，在小鼠雙側動脈血流阻斷加硝普鈉法、小鼠雙側動脈血流阻斷法、線圈法(頸部動脈單側直徑

16、0.18、0.20mm)致小鼠慢性腦血流低灌注血管性癡呆模型中，以線圈法(頸部動脈單側直徑0.20mm)為最優(yōu)。
　　2)新型鈣調素抑制劑DY98和其PSA膠束均顯示出對慢性腦缺血低灌注VD模型小鼠學習記憶功能障礙有改善作用。
　　3)首次采用多聚唾液酸作為藥物載體負載鈣調素抑制劑，并開展藥效學研究，發(fā)現(xiàn)0.25mg/kg鈣調素抑制劑DY98經(jīng)多聚唾液酸載可以起到高劑量組（1mg/kg）同等藥效。提示多聚唾液酸作為藥物載體在

17、提高藥物效應方面具有潛在的應用價值。
　　4)DY98及其PSA膠束通過減少海馬部位Nitrotyrosine過量表達、進而減輕硝化應激損傷和NLRP3/caspase-1/IL-1β關聯(lián)炎癥反應。經(jīng)由上述機制，DY98及其包合物增加海馬錐體神經(jīng)元CaMKⅡ蛋白磷酸化水平，改善慢性腦缺血低灌注VD模型小鼠學習記憶功能。鈣調素抑制劑DY98有望成為治療VD的候選化合物。
　　綜上所述，本研究建立優(yōu)化了小鼠雙側頸部動脈狹窄VD模