小鼠青光眼模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷與CD3ξ關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：青光眼是世界上最主要的不可逆性致盲性眼病之一，引起周邊視野的缺損直至中心視力消失。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglion cell，RGC)的凋亡是青光眼的最主要特征之一，但是RGC損傷的具體機(jī)制至今不明，如何減少青光眼RGC的損害是世界性難題，觀察RGC丟失的速度、形態(tài)的變化對(duì)揭示青光眼的病程有重要的臨床指導(dǎo)意義。傳統(tǒng)的研究RGC損傷的方法無(wú)法活體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)RGC的變化，目前國(guó)際上共焦激光顯微鏡活體觀察轉(zhuǎn)基因小鼠帶自

2、發(fā)熒光的RGC變化是一種新的趨勢(shì)，但是主要集中在觀察RGC數(shù)量的變化，最近有研究表明活體觀察猴和小鼠RGC樹(shù)突的可能性[1，2]，但是還沒(méi)有研究涉及到病理狀態(tài)下，對(duì)RGC形態(tài)變化的觀察。眼內(nèi)壓(introcularpressure，IOP)升高是青光眼發(fā)病的主要原因之一，但不能解釋青光眼發(fā)病的所有特征[3-6]。近年來(lái)免疫系統(tǒng)參與青光眼發(fā)病的相關(guān)研究越來(lái)越受關(guān)注。我們之前的研究已表明CD3ζ是影響RGC樹(shù)突形態(tài)和功能的關(guān)鍵因子，CD3ζ

3、-/-小鼠的樹(shù)突密度明顯大于同齡野生型小鼠[7]。ShRNA沉默CD3ζ在RGC的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致該細(xì)胞樹(shù)突明顯增加，CD3ζ影響了生理狀態(tài)下RGC樹(shù)突的形態(tài)和功能，病理狀態(tài)下是否導(dǎo)致了RGC的損傷有待進(jìn)一步研究。
　　 目的：
　　 建立青光眼動(dòng)物模型，選擇合適的模型活體觀察RGC變化，構(gòu)建mCherry CD3ζshRNA表達(dá)載體，研究CD3ζ與RGC損傷的關(guān)系，探討RNAi技術(shù)在視神經(jīng)保護(hù)中的運(yùn)用效果。
　　 方

4、法：
　　 1、三種青光眼模型的建立：1)視神經(jīng)挫傷模型：用能自動(dòng)閉合的鑷子夾傷視神經(jīng)。2)NMDA誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷模型：玻璃體腔內(nèi)注射N(xiāo)MDA(40nmol)導(dǎo)致RGC凋亡3)慢性高眼壓模型：前房?jī)?nèi)注射微珠(10×106microbeads/ml)堵塞前房角導(dǎo)致眼壓升高。
　　 2、RGC損傷的觀察：用共焦激光顯微鏡活體動(dòng)態(tài)觀察Thy1-CFP小鼠帶自發(fā)熒光的RGC的數(shù)量變化和和Thy1-YFP小鼠帶自發(fā)熒光的RGC的

5、形態(tài)變化。
　　 3、mCherry CD3ζshRNA表達(dá)載體構(gòu)建：mCherry CD3ζshRNA表達(dá)載體是由編碼shRNA的引物序列插入BamHI和XhoI位點(diǎn)之間。
　　 4、視網(wǎng)膜組織中CD3ζ的mRNA及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)：RT-PCR和Western blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中CD3ζ的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　 5、Brn3b陽(yáng)性的RGC檢測(cè)：將mCherry CD3ζshRNA注射入小鼠玻璃

6、體腔后，建立青光眼模型，取出視網(wǎng)膜行全視網(wǎng)膜鋪片，計(jì)數(shù)Brn3b陽(yáng)性的RGC。
　　 結(jié)果：
　　 1、建立了三種青光眼模型：1)視神經(jīng)損傷模型2)NMDA誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷模型3)慢性高眼壓模型
　　 2、視神經(jīng)挫傷模型RGC減少主要集中于術(shù)后一周，7天時(shí)RGC減少97.4％(P<0.001)，NMDA誘導(dǎo)的RGC減少主要集中于術(shù)后一天，24小時(shí)RGC減少94.7％(P<0.001)，慢性高眼壓導(dǎo)致的RGC減少持

7、續(xù)緩慢，第4周RGC減少26.7％(P<0.001)。
　　 3、用Thy1-CFP小鼠和Thy1-YFP小鼠建立慢性高眼壓模型，活體觀察結(jié)果顯示，Thy1-CFP小鼠3周后RGC減少21％±4.8％(P<0.001)，6周后RGC減少30％±4.7％(P<0.001)，Thy1-YFP小鼠的RGC的樹(shù)突丟失早于胞體消失。
　　 4、成功構(gòu)建了mCherry-CD3ζshRNA的表達(dá)載體，CD3ζshRNA減少HEK29

8、3的70％的CD3ζ表達(dá)。
　　 5、三種青光眼模型視網(wǎng)膜組織中CD3ζ的mRNA表達(dá)上升(P<0.05)，CD3ζ蛋白質(zhì)表達(dá)水平與正常視網(wǎng)膜相比沒(méi)有明顯變化。
　　 6、玻璃體腔注射mCherry CD3ζshRNA的三種青光眼模型中RGC的丟失沒(méi)有明顯減少(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、視神經(jīng)挫傷模型引起的RGC減少主要集中在術(shù)后一周，NMDA誘導(dǎo)的RGC減少主要集中于術(shù)后24小時(shí)，而前房

9、內(nèi)注射微珠堵塞房角誘發(fā)的高眼壓模型的RGC減少是持續(xù)緩慢的，更加擬合臨床青光眼的狀態(tài)。
　　 2、可利用共焦激光顯微鏡活體觀察已建立慢性高眼壓模型的Thy1-CFP小鼠的RGC的數(shù)量減少和Thy1-YFP小鼠的RGC的樹(shù)突丟失。
　　 3、視神經(jīng)挫傷模型、NMDA誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷模型、慢性高眼壓模型的視網(wǎng)膜組織中CD3ζ的mRNA水平表達(dá)上升，但CD3ζ的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，玻璃體腔注射mCherry CD3ζshR