低氧對(duì)樹突狀細(xì)胞凋亡及遷移功能影響及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、氧是一種環(huán)境刺激及發(fā)育信號(hào)，氧能調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量產(chǎn)生、生長(zhǎng)和分化過(guò)程并調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)表型性狀。生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化，已形成一套完整的氧感受機(jī)制及在不同氧環(huán)境下的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對(duì)保障組織細(xì)胞的正常功能具有重要的作用。組織缺氧可以在不同的細(xì)胞類型中通過(guò)不同機(jī)制調(diào)節(jié)基因的表達(dá)產(chǎn)生適應(yīng)性應(yīng)答。樹突狀細(xì)胞(DCs)是體內(nèi)具有最強(qiáng)抗原提呈功能的專職抗原提呈細(xì)胞(APC)，因此是機(jī)體免疫應(yīng)答的主要啟動(dòng)者，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。人體內(nèi)胸腺、脾臟

2、及淋巴組織均屬于生理性“低氧”器官，其氧水平遠(yuǎn)低于大氣氧水平，DCs在體內(nèi)定居在不同的淋巴器官，氧的生理水平就是“低氧”狀態(tài)。而DCs參與人體內(nèi)許多的具有局部低氧特征的生理及病理生理過(guò)程(如腫瘤、自身免疫病、感染性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等)，在其分化成熟、行使功能過(guò)程中遷移至局部及次級(jí)淋巴組織，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。DCs的低氧適應(yīng)在產(chǎn)生的免疫應(yīng)答性質(zhì)、強(qiáng)度及在疾病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸中可能起重要的作用。所以研究DCs低氧適應(yīng)機(jī)制對(duì)DCs生理及病理

3、變化的基礎(chǔ)研究及DCs應(yīng)用研究等有著十分重要的意義。 一、目的：人體內(nèi)是生理性低氧的微環(huán)境，免疫細(xì)胞分化發(fā)育、應(yīng)答及發(fā)揮效應(yīng)的過(guò)程均在低氧下發(fā)生，DCs作為專職APC在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，所以研究人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞低氧適應(yīng)機(jī)制，不僅對(duì)以往建立的體外免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)研究模式提出了新的問(wèn)題與思考，也將對(duì)腫瘤、炎癥等許多疾病的發(fā)生及防治提出新的見(jiàn)解及研究策略。 二、方法：1.低氧環(huán)境下人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的

4、DCs在rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α等誘導(dǎo)下進(jìn)行培養(yǎng)。2.在培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)觀察DCs的細(xì)胞形態(tài)。3.于培養(yǎng)的第7天，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同條件下DCs的CD1a、CD14、CD86、CD83、CD80、HLA-DR、CD209的表達(dá)。4.于培養(yǎng)的第5天和第7天，用流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙參數(shù)法檢測(cè)不同條件下DCs的細(xì)胞凋亡率。5.于培養(yǎng)的第7天，用Matrigel穿膜法檢測(cè)了低氧環(huán)境對(duì)DCs遷移能力的影響。6.于培

5、養(yǎng)的第5天和第7天，取低氧環(huán)境和常氧環(huán)境下的各組DCs，提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、標(biāo)記后與人表達(dá)譜基因芯片雜交。 三、結(jié)果：1.DCs在低氧和常氧環(huán)境下形態(tài)變化相同，并均觀察到了具有典型細(xì)胞形態(tài)的未成熟DCs和成熟DCs。2.低氧和常氧環(huán)境下的DCs均具有典型的DCs表型，且低氧環(huán)境和常氧環(huán)境下表型無(wú)顯著性差異。3.低氧環(huán)境下未成熟DCs的細(xì)胞凋亡率與常氧環(huán)境下的未成熟DCs相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；低氧環(huán)境下成熟DCs的細(xì)

6、胞凋亡率與常氧環(huán)境下的成熟DCs相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。4.與常氧環(huán)境下的DCs相比，低氧環(huán)境下DCs穿過(guò)Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。5.基因芯片雜交后，經(jīng)microarraysuite5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，獲得了大量差異表達(dá)基因。通過(guò)對(duì)Bcl-2基因家族中BCL2、BAX、BCL2A1、BCL2L11、BCL2L13、BCLAF1、BID、BAG1、BNIP3、BNIP3L等差異表達(dá)基因的分析

7、，結(jié)果表明在低氧環(huán)境下未成熟DCs、成熟DCs可能通過(guò)Bcl-2等抗凋亡基因的表達(dá)上調(diào)和BAX等促凋亡基因的表達(dá)下調(diào)抑制細(xì)胞的凋亡。通過(guò)對(duì)MMPs及TIMPs的基因表達(dá)變化的分析，結(jié)果表明低氧環(huán)境下DCs可能通過(guò)影響MMPs/TIMPs基因的表達(dá)平衡，從而導(dǎo)致其的遷移能力的降低。 四、結(jié)論：上述的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：低氧環(huán)境不影響DCs的細(xì)胞形態(tài)、表型及其凋亡；但低氧環(huán)境可顯著抑制DCs的遷移能力。表明在DCs低氧適應(yīng)機(jī)制中，其可能通