黃芪多糖的制備及其對巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響.pdf

1、黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是黃芪的重要生物活性成分之一，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能，抗腫瘤、抗氧化等生物學(xué)功能。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗原提呈功能最強的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，在啟動T細(xì)胞對病原微生物或抗腫瘤的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。巨噬細(xì)胞是機體重要的免疫細(xì)胞，具有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等重要功

2、能。樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在先天性免疫防御和獲得性免疫應(yīng)答中起著重要的作用。
　　 本課題主要分為三個部分進行，第一部分：黃芪飲片粉末經(jīng)水提，除蛋白、梯度醇沉等步驟獲得粗多糖進一步進行凝膠過濾，分步收集洗脫液，利用六種標(biāo)準(zhǔn)分子量的多糖建立了凝膠尺寸排阻色譜法(GPC-SEC-HPLC)檢測APS分子量的方法，得到了三個多糖組分，選擇平均分子量相對均一、得率、純度較高的APS(組分Ⅱ，MW6.9×104Da)作為進一步研究的實驗材料

3、。
　　 第二部分：研究APS對巨噬細(xì)胞功能的影響。用熒光染料2-氨基吖啶酮(2-AMAC)對APS進行熒光標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡觀察2-AMAC標(biāo)記的APS(2-AMAC-APS)與RAW264.7巨噬細(xì)胞的結(jié)合情況。通過Griess法和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)，研究APS對巨噬細(xì)胞NO和細(xì)胞因子TNF-α，GM-CSF分泌的影響，用LPS的抑制劑多粘菌素B(PMB)來研究制備的APS是否被內(nèi)毒素污染；Westernbl

4、ot法研究APS對RAW264.7巨噬細(xì)胞核內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(NF-κB)二聚體中p65含量的變化，以及NF-κB抑制劑對APS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO和TNF-α的影響；利用Toll樣受體4(TLR4)的抗體研究APS是否參與了對巨噬細(xì)胞NO生成的誘導(dǎo)，初步探討TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在APS激活巨噬細(xì)胞中的可能作用。
　　 第三部分：通過體外實驗研究APS對DC表型和功能的影響，為進一步闡明AP

5、S的免疫調(diào)節(jié)機制提供依據(jù)。分四組分別為APS實驗組(包括APS和APS-B)、LPS陽性對照組和RPMI-1640培養(yǎng)液陰性對照組，流式細(xì)胞儀檢測DC表面分子CD11c和MHCⅡ類分子的表達；FITC-dextran用以觀察APS、LPS刺激DC后對其吞噬功能的影響；酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測DC培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素-12(IL-12)的含量；掃描電鏡觀察DC的超微結(jié)構(gòu)。
　　 實驗結(jié)果顯示：MW6.9×104Da的APS重0.952

6、g，糖含量92％；2-AMAC-APS可以時間依賴性的與巨噬細(xì)胞結(jié)合，未標(biāo)記的APS能競爭性抑制該結(jié)合效應(yīng)，這與巨噬細(xì)胞表面相關(guān)受體的飽和程度有關(guān)。50,100μg/mlAPS實驗組可明顯誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NO的生成(P＜0.05)。25，50,100μg/mlAPS實驗組可促進巨噬細(xì)胞TNF-α，GM-CSF的生成，而且呈明顯的劑量依賴關(guān)系(P＜0.05)。PMB與APS聯(lián)合使用對巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)NO生成的影響不顯著(P＞0.05)，表明基本可

7、以排除APS受LPS污染的可能性。TLR4抗體能夠抑制APS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO；Western blot結(jié)果顯示APS作用于RAW264.7細(xì)胞6h，核內(nèi)p65的含量達到高峰；NF-κB抑制劑PDTC可明顯抑制APS對巨噬細(xì)胞NO和TNF-α的誘導(dǎo)作用。
　　 APS能夠提高DC表面分子CD11c和MHCⅡ的表達，并呈濃度依賴性；空白組DC的吞噬功能很強，LPS陽性對照組DC和APS實驗組DC的吞噬功能都明顯下降；

8、APS能夠促進DC分泌IL-12；電鏡觀察DC的超微結(jié)構(gòu)，可見APS實驗組DC突起增多，形態(tài)上更加成熟。
　　 結(jié)論：
　　 1.建立了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的APS分離純化方法和分子量檢測方法，可根據(jù)需要得到不同平均分子量的APS。
　　 2.APS能夠通過TLR4與巨噬細(xì)胞RAW264.7結(jié)合，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α和GM-CSF。
　　 3.APS能夠誘導(dǎo)DC表面MHCⅡ類分子I-A/I-E的表