乙型肝炎病毒感染轉(zhuǎn)歸及疫苗免疫應(yīng)答影響因素研究.pdf

1、前言：
　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一個世界性的衛(wèi)生問題，它能引起肝炎、肝硬化、甚至肝細胞癌，嚴重危害人類健康。我國是乙肝病毒感染大國，目前我國1-59歲人群乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)攜帶率為7.18％，據(jù)此推算，我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約為9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬。
　　不同個體感染HBV后，結(jié)局

2、不盡相同。成年人感染HBV后約90％-95％的感染者可自發(fā)清除病毒而免受疾病侵襲。另外，約5％-10％的HBV感染者會轉(zhuǎn)為慢性感染。影響HBV感染后臨床轉(zhuǎn)歸的因素非常復雜，包括感染年齡、病毒基因型、宿主基因型等。近年來關(guān)于編碼多種細胞因子如干擾素、白細胞介素和腫瘤壞死因子等的基因多態(tài)性與HBV感染結(jié)局的相關(guān)性研究成為熱點并且已經(jīng)得到證實。隨著分子生物學技術(shù)和基因組學的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一大批與HBV感染相關(guān)的基因，并且部分HBV感染相關(guān)的

3、基因已經(jīng)得到精確的定位和功能研究。這些研究均提示，個體間某些細胞因子、蛋白質(zhì)分子的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)可能是導致機體免疫功能狀態(tài)差異的重要因素，并最終影響著HBV感染的不同臨床轉(zhuǎn)歸。
　　近年來，越來越多的研究顯示固有免疫分子和固有免疫應(yīng)答在抗病毒感染中發(fā)揮重要作用，其中三基序(tripartite motif, TRIM)蛋白家族是當前抗病毒固有免疫中的研究熱點之一

4、。TRIM22分子新近被證實具有抑制乙肝病毒的作用而受到關(guān)注。對于乙肝病毒感染者而言，一旦激發(fā)體內(nèi)的TRIM22分子，攜帶者便可誘發(fā)相應(yīng)免疫應(yīng)答，抑制病毒復制，清除體內(nèi)的乙肝病毒，這就說明了在一定程度上TRIM22分子起到了控制乙肝病毒“開關(guān)”的作用。關(guān)于TRIM22基因SNP是否影響了機體對HBV的免疫應(yīng)答，從而導致HBV感染的不同臨床轉(zhuǎn)歸，目前尚未見相關(guān)報道。
　　乙肝疫苗接種是預(yù)防HBV感染的有效措施，我國目前對新生兒實行乙

5、肝疫苗免疫接種，已使5歲以下兒童的HBsAg攜帶率降至0.96％。然而，未免疫人群及高危人群仍然處于乙肝病毒感染的威脅中。另外，盡管接受標準的乙肝疫苗免疫接種，仍有4％-10％的健康受試者不能產(chǎn)生足夠的保護性抗體。如何對這些人群采取有效措施預(yù)防HBV感染仍是面臨的重要任務(wù)。
　　鋅作為一種必須的微量元素，參與包括信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄和復制等許多病理生理過程，在免疫系統(tǒng)的發(fā)育及免疫功能的維持中發(fā)揮重要作用。2003年，WHO就將鋅缺乏認定

6、為引發(fā)疾病的首要危險因素之一。有數(shù)據(jù)顯示9.5％的美國人和33.1％的東南亞人存在鋅攝入量不足，尤其在妊娠期，由于對鋅的需求量劇增，孕婦和胎兒更容易出現(xiàn)鋅缺乏。而鋅缺乏是造成哺乳動物免疫功能缺陷最常見的原因之一，妊娠期鋅缺乏不僅影響母體的免疫功能，而且導致新生兒免疫功能缺陷。鋅缺乏可以降低流感疫苗、霍亂疫苗等多種疫苗的免疫接種效力。然而，目前還沒有關(guān)于妊娠期鋅缺乏對子代接種乙肝疫苗免疫應(yīng)答影響的相關(guān)研究報道。
　　本研究從機體對H

7、BV免疫應(yīng)答的角度，探討了TRIM22單核苷酸基因多態(tài)性與HBV感染不同臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，為闡明HBV感染者不同臨床轉(zhuǎn)歸的免疫遺傳機制提供科學依據(jù)，對感染者的預(yù)后判斷及HBV的防治策略提供科學依據(jù);同時從機體對疫苗免疫應(yīng)答的角度對妊娠期鋅缺乏與仔鼠乙肝疫苗免疫效力之間的關(guān)系和機制進行研究，可以為明確乙肝疫苗免疫后無應(yīng)答或弱應(yīng)答的機制，探討妊娠期預(yù)防性補鋅策略的可行性，以期改善和提高乙肝疫苗接種效果提供理論及實驗依據(jù)。
　　實驗方法：

8、
　　以293例慢性乙型肝炎患者、224例HBsAg攜帶者和248例自限性HBV感染者為研究對象，應(yīng)用血生物化學方法檢測ALT、AST、TBiL、ALB、PTA、CHE水平，應(yīng)用HBV核酸定量檢測試劑盒檢測HBVDNA水平，從各組受試對象外周血單個核細胞中提取基因組DNA，針對TRIM22編碼基因目的區(qū)域RING區(qū)和SPRY區(qū)設(shè)計引物并進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在ABI3700型DNA自動化測序儀上進行測序分析，計算基因型頻率及等位

9、基因頻率，應(yīng)用SAS統(tǒng)計分析軟件包進行統(tǒng)計學分析。
　　以飼喂不同含鋅量飼料的BALB/c孕鼠子代作為研究對象，仔鼠出生后24小時內(nèi)及第2周和第4周末進行乙肝疫苗全程免疫接種。末次接種兩周后處死仔鼠，取血液標本，應(yīng)用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測鋅含量，應(yīng)用ELISA法檢測HBsAg特異性抗體及其亞型。制備脾淋巴細胞，檢測HBsAg特異性增殖應(yīng)答。流式細胞儀檢測細胞表面分子確定淋巴細胞分類及數(shù)量，檢測細胞內(nèi)因子IFN-γ和IL-4與C

10、D4+和CD8+T細胞的共表達水平，應(yīng)用ELISA法檢測脾單細胞懸液培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4濃度。
　　實驗結(jié)果：
　　一、TRIM22基因RING區(qū)及SPRY區(qū)單核苷酸基因多態(tài)性檢測
　　1、研究對象的人口學特征及環(huán)境危險因素分布
　　慢性肝炎組的年齡及飲酒者的比例顯著高于HBsAg攜帶組;兩組在性別、吸煙方面無顯著差異。慢性肝炎組與自限性感染組在年齡、吸煙和飲酒方面無顯著差異;慢性肝炎組男性患者的比例顯

11、著高于自限性感染組。
　　2、TRIM22基因RING區(qū)及SPRY區(qū)測序結(jié)果
　　對TRIM22編碼基因RING區(qū)及SPRY區(qū)測序后共檢測到3處SNP位點，分別為RING區(qū)-336G/A;RING區(qū)-364T/C位點和SPRY區(qū)-7C/T。RING區(qū)-364T/C位點檢測到TT、TC、CC三種基因型，-336G/A位點檢測到GG及GA兩種基因型，-7C/T位點檢測到CC及CT兩種基因型。
　　二、TRIM22基因RIN

12、G區(qū)及SPRY區(qū)的SNP與HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性研究
　　1、慢性感染者基因型與HBVDNA載量相關(guān)
　　將慢性肝炎組與HBsAg攜帶組合并進行分析發(fā)現(xiàn)，在HBV慢性感染者中，-364T/C位點CC基因型的病毒載量高于TC+CC基因型者。
　　2、慢性肝炎組基因型與轉(zhuǎn)氨酶水平相關(guān)性
　　慢性肝炎組中，-364T/C位點CC基因型的患者ALT、AST水平低于TC+TT基因型患者。
　　3、TRIM22基因

13、RING區(qū)基因型與等位基因的頻率分布
　　慢性肝炎組與HBsAg攜帶組TRIM22基因RING區(qū)SNP位點-364T/C的基因型與等位基因頻率無顯著差異。慢性肝炎組-364CC基因型頻率顯著高于自限感染組，慢性肝炎組-364C等位基因頻率顯著高于自限感染組。
　　4、TRIM22基因RING區(qū)SNP與HBV感染結(jié)局相關(guān)性的Logistic回歸分析
　　以自限性HBV感染者為對照組對影響乙肝慢性化的宿主遺傳因素進行多因素

14、Logistic回歸分析，調(diào)整掉年齡、性別、吸煙、飲酒因素的影響后，-364T/C位點CC基因型是HBV感染慢性化的獨立危險因素。
　　三、妊娠期鋅缺乏對仔鼠體液免疫及細胞免疫應(yīng)答的影響
　　1、妊娠期鋅缺乏抑制免疫細胞向脾臟聚集
　　接種乙肝疫苗后對照組仔鼠脾細胞數(shù)顯著增多，而ZD組和ZS組脾細胞數(shù)量與未接種疫苗的仔鼠相比無顯著差異。
　　2、妊娠期鋅缺乏對小鼠脾臟T細胞數(shù)量和細胞免疫應(yīng)答的影響
　　與對

15、照組相比，ZD組仔鼠脾T細胞的絕對數(shù)量顯著降低，但T細胞在全脾細胞中比例卻升高，ZD仔鼠脾的CD4+T細胞在脾T細胞中的比例顯著降低，而CD8+T細胞的比例卻有明顯的升高，CD4+/CD8+比值降低。
　　3組仔鼠脾細胞經(jīng)rHBsAg刺激72 h后，ZD和ZS組均未發(fā)生明顯的增殖。
　　3、妊娠期鋅缺乏對小鼠脾臟B細胞數(shù)量和體液免疫應(yīng)答的影響
　　與對照組相比，ZD組仔鼠脾CD19+B細胞不僅絕對數(shù)量顯著降低，而且在全

16、脾細胞中的比例也顯著降低。ZS組仔鼠的妊娠晚期補鋅治療對B細胞數(shù)量及在全脾細胞中的比例并無改善作用。
　　ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，ZD組仔鼠的總IgG水平以及IgG2a和IgG1水平均顯著低于對照組，并且IgG2a/IgG1比值也顯著降低。
　　四、妊娠期鋅缺乏影響仔鼠體液免疫及細胞免疫應(yīng)答的機制
　　1、妊娠期鋅缺乏對Th1和Th2類細胞因子釋放的影響
　　ELISA法對3組仔鼠脾細胞分泌IFN-γ和IL-4的水

17、平進行檢測，發(fā)現(xiàn)與ZD和ZS組仔鼠脾細胞分泌的IFN-γ顯著降低，而3組間IL-4水平無統(tǒng)計學差異。
　　2、妊娠期鋅缺乏對脾CD4+T細胞IFN-γ和IL-4表達的影響
　　3組仔鼠脾細胞懸液經(jīng)rHBsAg刺激72 h，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，ZD組仔鼠HBsAg特異性CD4+T細胞中IFN-γ表達的水平最低，ZS組仔鼠與ZD組相比并無顯著差異。3組動物IL-4表達水平無統(tǒng)計學差異。
　　3、妊娠期鋅缺乏對脾CD8+T細

18、胞IFN-γ表達的影響
　　與對照組比較后發(fā)現(xiàn)，ZD組仔鼠表達IFN-γ的HBsAg特異性CD8+T細胞明顯減少，而ZS組仔鼠與ZD組相比并無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.遼寧省漢族HBV感染者TRIM22蛋白RING區(qū)及SPRY區(qū)編碼基因SNP主要發(fā)生在-364T/C位點。
　　2.TRIM22蛋白RING區(qū)編碼基因-364T/C位點SNP與HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)， CC基因型是HBV感染慢性化獨立危險因素。