自噬在乙型肝炎病毒感染中的作用研究.pdf

1、目的：自噬作為先天性免疫的一部分在多種病原體的入侵過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的保護(hù)性作用，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的感染可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，但該自噬過程對(duì)HBV并沒有清除作用。本課題主要研究HBV所誘導(dǎo)的自噬無法清除 HBV的原因及其潛在的機(jī)制。
　　方法：HBV質(zhì)粒p1.3HBV（pHBV）轉(zhuǎn)染HepG2（pHepG2）細(xì)胞，western blot方法檢測HepG2細(xì)胞、pHepG2細(xì)胞、饑餓誘導(dǎo)自

2、噬處理的HepG2細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)HBV DNA的HepG2.2.15細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白（autophagy-related protein，Atg）5、微管相關(guān)蛋白輕鏈（microtubule-associated protein light chain3-II，LC3-II）的表達(dá)。透射電鏡的方法直接觀察 HepG2細(xì)胞和 pHepG2細(xì)胞中自噬小體的形成。將pHBV質(zhì)粒通過尾靜脈高壓注射C57BL/6構(gòu)建小鼠肝炎模型，96小時(shí)后收集

3、小鼠血清和肝組織，分別用 Roche COBAS HBV Amplicor MonitorTM和ARCHITECT i2000SR HBsAg QT的方法檢測小鼠血清中HBV DNA和乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）的含量；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色的方法分析小鼠肝臟組織學(xué)改變情況；western blot的方法分析小鼠肝組織中Atg5和 LC3-II

4、的表達(dá)；熒光共聚焦顯微鏡檢測HepG2細(xì)胞和pHepG2細(xì)胞中自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體的情況；半定量PCR方法檢測HepG2細(xì)胞、pHepG2細(xì)胞、饑餓誘導(dǎo)自噬處理的HepG2細(xì)胞及HepG2.2.15細(xì)胞中Ras相關(guān)蛋白7（Ras-related protein7，Rab7）mRNA的表達(dá)情況，western blot方法檢測上述四組細(xì)胞中 Rab7蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，pHepG2細(xì)胞、HepG2

5、.2.15細(xì)胞和饑餓誘導(dǎo)自噬處理的HepG2細(xì)胞中Atg5和LC3-II的表達(dá)均明顯升高；此外，透射電鏡觀察到，與HepG2細(xì)胞相比，自噬小體在pHepG2細(xì)胞中的積聚更明顯；pHBV質(zhì)粒尾靜脈高壓注射可以引起小鼠肝臟明顯的炎性改變，肝炎小鼠肝組織中 Atg5和LC3-II的表達(dá)也明顯升高；關(guān)于自噬流變化的研究中發(fā)現(xiàn)，pHepG2細(xì)胞中自噬小體和溶酶體的融合受阻；此外，與對(duì)照組相比，Rab7在饑餓誘導(dǎo)自噬處理的HepG2細(xì)胞中明顯升高，