利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)清除乙肝病毒(HBV)感染的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染會引起慢性肝炎、肝硬化及細胞癌等肝臟疾病，全球每年約有100萬人死于乙肝病毒感染引起的肝臟疾病。雖然乙肝疫苗的廣泛應(yīng)用在很大程度上預(yù)防了乙肝病毒的傳播，然而慢性乙肝的治療一直處于困境。目前公認有效的治療藥物主要為核苷酸類似物，但核苷酸類似物僅能暫時降低患者血清中的病毒載量，甚至有停藥后再度暴發(fā)的風險。這主要是因為目前臨床上的治療方法均不能清除乙肝慢性感染和復發(fā)的根源，也就是肝

2、細胞內(nèi)乙肝病毒的共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）和HBV在復制過程中整合至宿主細胞基因組上的整合狀態(tài)HBV DNA。因此，探尋從根本上清除HBV的方法成為治療慢性乙肝的當務(wù)之急。
　　近年來基于細菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR開發(fā)出的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)幾乎可以對任何物種進行DNA的精確編輯，這一方便、快捷的技術(shù)使得從根本上清除HBV cccDNA和整合狀態(tài)的HBV DNA成為了可能。在本研究中，我們首先利用CRIS

3、PR-Cas9基因編輯技術(shù)在HBV細胞模型以及HBV小鼠模型中實現(xiàn)了對乙肝病毒復制根源HBV cccDNA的靶向剪切以及對乙肝病毒復制與表達的高效抑制。隨后，我們又利用該技術(shù)在清除HBV cccDNA的同時，完全清除了HBV細胞模型中全長整合的HBV基因組，實現(xiàn)了對感染細胞中HBV更加徹底的清除。最后，為了檢測CRISPR-Cas9在清除HBV過程中對細胞基因組造成的影響，我們利用全基因組測序技術(shù)評估了感染及清除HBV前后宿主細胞基因組

4、的變化，并首次發(fā)現(xiàn)了宿主細胞基因組上有大量SNP會隨著HBV的清除而恢復至HBV感染前的類型。
　　1.CRISPR-Cas9抑制HBV復制與表達的研究
　　（1）剪切HBV DNA的高效gRNA靶點篩選
　　由于HBV基因組變異位點較多，開放閱讀框高度重疊，且宿主細胞中存在多種形式的HBV DNA，為了篩選出能夠高效剪切HBV基因組的gRNA靶點，我們通過生物信息學比對以及對CRISPR-Cas9剪切活性的檢測，從8

5、個候選gRNA中篩選出了對HBV DNA剪切及抑制效率最高的gRNA-S4靶點。通過深度測序，我們證實了該系統(tǒng)對HBV基因組的剪切作用并評估了該系統(tǒng)的剪切效率。
　?。?）利用gRNA-S4系統(tǒng)高效抑制細胞及小鼠體內(nèi)HBV的復制與表達
　　我們利用HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系HepG2.A64以及HBV高壓水動力小鼠分別作為模型，分別檢測了gRNA-S4在體內(nèi)、外對HBV復制的抑制效果。結(jié)果顯示，gRNA-S4在細胞中高效抑制了HBV復

6、制與表達并將HBV cccDNA含量降低了95.37±0.64％。我們還利用該系統(tǒng)將HBV高壓水動力小鼠血清中的HBsAg含量降低了99.92±0.04%，將小鼠血清中的HBV DNA降至了陰性臨界值以下。
　?。?）CRISPR-Cas9靶向HBV的特點分析
　　在上述實驗中，由于細胞中存在多種形式的HBV DNA，其中環(huán)狀HBV DNA在CRISPR-Cas9剪切后即降解。因此，我們在研究中發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9對細

7、胞中HBV的剪切效率實際上要遠低于對HBV表達的抑制效率。此外，由于HBV基因組編碼區(qū)的高度重疊，我們僅用破壞一個位點便可抑制HBV全部基因的表達。
　　2.CRISPR-Cas9清除整合狀態(tài)HBV DNA的研究
　　HBV在感染過程中會將病毒基因組整合到宿主細胞染色體上，而這些整合的HBV DNA被認為是肝細胞癌發(fā)生的重要因素，會引起宿主基因組的變異進而改變細胞增殖與分化相關(guān)基因的表達。同時，實驗室常用的HBV轉(zhuǎn)基因細胞模

8、型中除了含有HBV cccDNA均整合有HBV的全長基因組，且全長整合的HBV DNA是穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞模型中HBV復制與表達的主要模板。因此，為了實現(xiàn)對HBV感染的清除，除了靶向降解HBV cccDNA之外，我們還必須清除細胞染色體上全長整合的HBV DNA。由于HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中的乙肝病毒生活周期及復制模式與實際情況類似，均存在HBV cccDNA和HBV復制中間體等多種形式的HBV DNA。因此利用CRISPR-Cas9在 HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞模

9、型中清除全長整合的HBV DNA同樣能夠很好地模擬真實感染中清除HBV DNA整合片段的過程。
　?。?）建立了特異性擴增HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中全長整合HBV DNA的新方法
　　由于HBV細胞模型中HBV整合位點較多，且細胞內(nèi)存在多種形式的HBV DNA，利用Alu-PCR以及細胞全基因組測序均難以定位出全長整合HBV基因組的具體位置。在本部分實驗中，我們建立了一種特異性擴增HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞模型中全長整合HBV基因組的新方法，即利

10、用HBV全長整合位點3’端外源啟動子特異性引物，實現(xiàn)對細胞基因組中全長整合HBV基因組的擴增。
　　（2）首次清除HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中全長整合的HBV DNA
　　我們利用靶向全長整合HBV基因組兩端側(cè)翼序列的gRNA-69系統(tǒng)成功清除了細胞中全長整合的HBV基因組。在清除細胞中全長整合的HBV DNA后，細胞中的HBV cccDNA、HBsAg、HBeAg、HBV DNA在連續(xù)300天的培養(yǎng)中均無法檢出。這部分結(jié)果表明，我們首

11、次利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除了細胞內(nèi)的HBV感染。
　　3.清除HBV前后宿主細胞全基因組測序及分析
　?。?）清除HBV感染后細胞基因組中HBV整合位點大量消失
　　為了探究CRISPR-Cas9在清除HBV的過程中對宿主細胞基因組可能造成的影響，我們對HBV清除前后的細胞株以及HBV整合前的HepG2細胞株分別進行了全基因組測序。通過對3株細胞HBV整合位點的分析，我們發(fā)現(xiàn)相比清除HBV前的細胞HepG2.

12、A64，清除了HBV后的69-7細胞基因組中HBV的隨機整合位點減少了97.7%。
　?。?）清除HBV感染后細胞基因組中大量SNP恢復至HBV感染前狀態(tài)
　　通過對HBV感染及清除前后3個細胞基因組上突變尤其是SNP的分析，我們發(fā)現(xiàn)，HBV感染后的A64細胞中共有2,284,202個SNP位點發(fā)生了變異，而其中的2,093,238的SNP位點在HBV被清除后恢復成了HBV感染前的狀態(tài)。
　?。?）排除CRISPR-C

13、as9脫靶效應(yīng)及細胞污染的可能性
　　為了進一步探究清除HBV感染后宿主細胞基因組突變恢復的原因，我們首先利用同源序列分析了gRNA的脫靶效應(yīng)，證實了gRNA-69不存在明顯的脫靶效應(yīng)。然后通過對HBV整合位點的分析，證實了清除HBV后的69-7細胞并非此前HBV感染細胞A64中污染的HepG2細胞。最后通過對gRNA-69剪切后的殘余序列進一步分析，證實了清除HBV后的69-7細胞并非gRNA-69轉(zhuǎn)染之前存在于A64細胞中的亞

14、克隆，而是gRNA-69剪切A64細胞中HBV后所形成的細胞克隆。這部分結(jié)果否定了細胞基因組突變的恢復與CRISPR-Cas9的脫靶及細胞污染有關(guān)。
　?。?）清除HBV感染后細胞基因組突變恢復的原因分析
　　通過對HBV感染及清除前后細胞基因組SNP類型變化情況的分析結(jié)果以及宿主細胞DNA修復通路中RAD51基因表達量的檢測結(jié)果我們推測，這種雜合SNP的恢復或許是由于存在同源修復模板，進而在DNA修復系統(tǒng)的參與下實現(xiàn)的恢復

15、。
　　本次研究中，我們利用CRISPR-Cas9技術(shù)首次實現(xiàn)了對宿主細胞內(nèi)乙肝病毒感染的清除，深入分析了CRISPR-Cas9在清除HBV過程中的脫靶效應(yīng)、抑制效率以及作用時間。在清除了HBV感染后的細胞基因組中，我們還觀察到了大量HBV的整合位點以及宿主細胞基因組變異會隨著HBV的清除而恢復。本次研究展現(xiàn)了CRISPR-Cas9技術(shù)在根治慢性乙肝以及阻斷其向肝細胞癌發(fā)展方面的巨大潛力。此外，清除HBV感染后宿主細胞基因組上的新