乙肝病毒感染人胎肝細(xì)胞及苦參堿抗乙肝病毒的研究.pdf

1、第一部分： 目的：探討乙肝病毒感染原代培養(yǎng)的人胚胎肝細(xì)胞的機(jī)制。 方法：用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人的胚胎肝細(xì)胞，然后添加乙肝病毒感染；用ELISA與實時熒光定量PCR(FQ-PCR)測定每天收集培養(yǎng)的上清液；熒光定量PCR測定細(xì)胞內(nèi)含的乙肝病毒DNA(HBV—DNA)的量；免疫組化測定培養(yǎng)細(xì)胞里的HBcAg、肝細(xì)胞表型CKl8、CK8、白蛋白(ALB)、GST：每天測定培養(yǎng)上清的乳酸脫氫酶(LDH)來檢測細(xì)胞膜的完整性。

2、 結(jié)果：建立起穩(wěn)定的肝細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)；乙肝病毒能感染培養(yǎng)的胚胎肝細(xì)胞并且在細(xì)胞里復(fù)制；免疫組化能測到HBcAg在肝細(xì)胞中表達(dá)；FQ—PCR測定感染后的2-18天培養(yǎng)上清HBV-DNA為陽性結(jié)果；ELISA測定感染后3-18天培養(yǎng)上清的HBsAg及HBeAg為陽性結(jié)果。 討論：乙肝病毒能感染培養(yǎng)的胚胎肝細(xì)胞并且在細(xì)胞里復(fù)制；這種體外模式能為乙肝病毒感染肝細(xì)胞及在細(xì)胞中復(fù)制提供一個研究模型。 第二部分 目的：觀察氧化

3、苦參堿體外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。 方法：用各濃度的氧化苦參堿處理培養(yǎng)Hep G2-2.2.15細(xì)胞后(1000mg/L，800mg/mL，400mg/mL，200mg/mL，100mg/mL and 50mg/ml)，干擾素(IFN-α2b)1500u/L為陽性對照，空白為陰性對照。用流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化、DNA電泳觀察細(xì)胞的凋亡；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法觀察藥物的細(xì)胞毒性。每隔3天，用酶聯(lián)免疫法測(ELISA)

4、檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg、HBeAg含量，用實時熒光定量PCR檢測培養(yǎng)上清液種的HBV—DNA量的變化。 結(jié)果：半數(shù)抑制濃度1C<,50>是875mg/L，氧化苦參堿在50mg/L～800mg/L的濃度范圍內(nèi)，對HepG2-2.2.15細(xì)胞毒性較小，氧化苦參堿對HBsAg和HBeAg的抑制作用，在200mg/L～800mg/L劑量范圍內(nèi)逐漸增加，與1500U/L干擾素比較無顯著性差異(P(0.05)。 結(jié)論：體外細(xì)