利用CRISPR-Cas9敲除綿羊成纖維細(xì)胞MSTN基因的研究.pdf

1、目的：肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)，又稱生長/分化因子8( GDF8)，是TGF-β超家族成員之一，該基因?qū)趋兰〉纳L發(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用。該基因功能的缺失，能夠引起肉用動物的“雙肌”表型，從而提高動物的產(chǎn)肉率。Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR- associated(Cas)9系統(tǒng)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸

2、酶(transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)是兩種最新人工設(shè)計核酸酶，可用于各種復(fù)雜的基因組編輯。本研究通過設(shè)計 CRISPR/Cas9和TALEN兩種人工核酸酶分別作用于綿羊 MSTN基因第一外顯子和第三外顯子，通過電轉(zhuǎn)染的方式將 CRISPR/Cas9和 TALEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)入綿羊成纖維細(xì)胞，以期獲得 MSTN基因發(fā)生突變的綿羊成纖維細(xì)胞，為獲得 MSTN基因突變的轉(zhuǎn)基因肉

3、羊研究工作奠定基礎(chǔ)。
　　方法：試驗一采用 Golden Gate等構(gòu)建方法，對構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行感受態(tài)轉(zhuǎn)化和去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取，利用瓊脂糖電泳檢測是否成功構(gòu)建 Cas9和 TALEN質(zhì)粒。試驗二采用 Lonza4D- Nucleofector電轉(zhuǎn)染設(shè)備和試驗室配制的電轉(zhuǎn)液 L，將 pMAX綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入綿羊成纖維細(xì)胞。通過對電轉(zhuǎn)染程序、細(xì)胞數(shù)量、質(zhì)粒濃度、不同電擊次數(shù)以及電轉(zhuǎn)后不同的放置溫度等幾個條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)流式細(xì)胞儀

4、測定和熒光顯微鏡觀測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，以期得到 L電轉(zhuǎn)液最佳電轉(zhuǎn)方案。試驗三通過電轉(zhuǎn)染的方法將CRISPR/cas9和 TALENs質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到綿羊成纖維細(xì)胞，采用 Surveyor nuclease、T7E1（T7 Endonuclease1）和 HRM(High Resolution Melt)三種檢測方法，檢測作用于綿羊 MNST基因第一外顯子 CRISPR/Cas9和第三外顯子 TALEN的生物學(xué)活性，確定目標(biāo)靶點 DNA是否發(fā)生突

5、變。試驗四將鑒定的具有 CRISPR/Cas9和 TALEN生物活性的細(xì)胞，進(jìn)行有限稀釋后，在體視顯微鏡下使用毛細(xì)管吸取單個細(xì)胞接種到96孔板中，每個孔中接種一個單細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)得到不同的單細(xì)胞系，將傳代培養(yǎng)的單細(xì)胞通過 HRM技術(shù)，PAGE檢測和直接測序三種方法鑒定突變的單克隆細(xì)胞。
　　結(jié)果：試驗一結(jié)果顯示經(jīng)瓊脂糖電泳檢測到 CRISPR/Cas9和 TALEN質(zhì)粒，其片段大小分別 CRISPR/Cas9質(zhì)粒9999bp，s

6、gRNA質(zhì)粒4930bp，TALENL/R質(zhì)粒8322bp，成功構(gòu)建 CRISPR/Cas9和 TALEN質(zhì)粒。試驗二結(jié)果顯示 L電轉(zhuǎn)液最佳電轉(zhuǎn)染方案：100μl的 L電轉(zhuǎn)液懸浮2×106個細(xì)胞，選擇 CZ-167電轉(zhuǎn)程序，質(zhì)?？偭繛?μg，電擊一次后37℃放置10min，可獲得理想的電轉(zhuǎn)染效率。試驗三檢測結(jié)果顯示作用于綿羊MNST基因第一外顯子 CRISPR/Cas9和第三外顯子 TALENs的目標(biāo)靶點均發(fā)生了突變。試驗四結(jié)果顯示將傳

7、代培養(yǎng)的單細(xì)胞通過 HRM技術(shù)，PAGE檢測和直接測序三種方法鑒定，成功篩選到單克隆突變細(xì)胞。
　　結(jié)論：1、成功構(gòu)建作用于綿羊 MSTN基因第一外顯子的 CRISPR/Cas9質(zhì)粒和第三外顯子的 TALEN質(zhì)粒。2、采用電轉(zhuǎn)染的方式將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入綿羊成纖維細(xì)胞中，通過 HRM、T7EI和 Surveyor三種方法檢測出 CRISPR/Cas9和 TALEN均發(fā)揮生物學(xué)活性，產(chǎn)生切割目標(biāo)靶點的作用。3、轉(zhuǎn)染的單細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增，