利用CRISPR-Cas9技術構建補體Ⅲ基因缺陷豬模型.pdf

1、C3是補體經(jīng)典途徑、旁路途徑以及甘露聚糖結合凝集素(MBL)途徑三者的交匯點，是宿主防御機制中占據(jù)核心地位的特殊分子，近年來受到廣泛關注。研究者采用C3基因敲除小鼠作為模式工具，對C3參與炎癥反應、免疫防御、免疫調控等方面進行深入探究，發(fā)現(xiàn)C3不僅與自身免疫病、腎小球腎炎等疾病發(fā)展密切相關，C3基因缺陷還可延長皮膚移植存活率，這說明C3對異種移植研究也有著重要意義。然而，由于嚙齒類動物補體系統(tǒng)與人之間存在重要差異，人類補體缺陷的病征不可

2、能在小鼠身上完全重現(xiàn)。而豬作為模型動物，其各項生理指標及內部器官組織結構都比嚙齒類動物和人類更相近，尤其免疫系統(tǒng)與人類極其相近。故本研究利用基因組編輯技術-規(guī)律成簇間隔短回文重復(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9)介導C3基因的敲除，并結合體細胞核移植技術制備了國際首批C3基因缺陷巴馬香豬模型，培育出補體系統(tǒng)缺陷的基因敲除豬

3、模型，為進一步探究C3對疾病發(fā)生機理、免疫缺陷帶來的影響提供更好的實驗材料。
　　本論文采用CRISPR/Cas9技術系統(tǒng)，在巴馬香豬C3基因第26個外顯子上設計sgRNA進行打靶，將設計好的C3-Cas9質粒與表達紅色熒光的tdTomato質粒共同核轉染豬成纖維細胞，使用G418篩選出表達抗性的細胞，并通過測序篩選出基因敲除的細胞，利用體細胞核移植(S CNT)技術，構建國際上首例C3基因敲除的克隆豬。然后對C3基因敲除豬進行基

4、因型鑒定。
　　實驗結果表明挑取細胞克隆46個，經(jīng)PCR產物測序，39個克隆發(fā)生基因突變，C3基因突變效率為84.7％;其中雙等位基因敲除細胞克隆有21個，雙等位基因敲除效率為45.7％。從中選擇3到4個C3基因有效雙等位基因敲除的細胞作為核供體進行體細胞核移植至六頭受體豬，一頭流產，四頭返情，一頭妊娠至終期，產仔豬6頭。第二批移植三頭受體豬，2頭妊娠至終期，產仔豬13頭。
　　綜上所述，本研究驗證了CRISPR/Cas9系