病毒介導(dǎo)CRISPR-Cas9煙草基因編輯系統(tǒng)的研究.pdf

1、分類(lèi)號(hào)密級(jí)UDC學(xué)號(hào)20131013016青海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文病毒介導(dǎo)CRISPRCas9煙草基因編輯系統(tǒng)的研究研究生姓名宗淵導(dǎo)師姓名（職稱(chēng)）李建民，教授申請(qǐng)學(xué)位類(lèi)別碩士學(xué)科專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)植物學(xué)研究方向名稱(chēng)植物生物技術(shù)論文提交日期2016年3月論文答辯日期2016年6月學(xué)位授予單位青海師范大學(xué)學(xué)位授予日期2016年6月答辯委員會(huì)主席周華坤評(píng)閱人，中文摘要基因組編輯是利用序列特異核酸酶在基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，激活細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)

2、制(非同源末端連接或同源重組)，實(shí)現(xiàn)基因敲除、染色體重組以及基因定點(diǎn)插入或替換的技術(shù)。當(dāng)有外源DNA或者病毒入侵CRISPRCas系統(tǒng)會(huì)將入侵的序列片段整合進(jìn)去，由特定的crRNA進(jìn)行同源序列的降解。該系統(tǒng)構(gòu)建簡(jiǎn)單、精準(zhǔn)度高、成本低、能同時(shí)對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)編輯。本研究探索了利用豌豆早褐病毒介導(dǎo)CRISPRCas9系統(tǒng)的關(guān)鍵因子crRNA和Cas9蛋白在煙草中表達(dá)，期望實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草基因進(jìn)行編輯。主要結(jié)果如下：1、設(shè)計(jì)煙草PDS基因的目標(biāo)編

3、輯序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，酶切，與酶切后的pCAPE2GFP連接獲得pCAPE2:crRNA載體。利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法獲得遍在表達(dá)Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因系。將pCAPE1和pCAPE2:crRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101把包含pCAPE1和pCAPE2:Cas9crRNA質(zhì)粒的農(nóng)桿菌1：1混合后侵染遍在表達(dá)Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因系，但未能發(fā)現(xiàn)基因組編輯表型。2、獲得煙草的crRNA序列。通過(guò)擴(kuò)增得到Cas9片段，將載體和兩個(gè)片段各自酶切，通過(guò)

4、T4連接酶對(duì)該三片段進(jìn)行連接，獲得pCAPE2:Cas9crRNA載體。將pCAPE1和pCAPE2:Cas9crRNA，分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，把包含pCAPE1和pCAPE2:Cas9crRNA質(zhì)粒的農(nóng)桿菌1：1混合后侵染煙草品種Samsun。注射后23周，在煙草的新生葉片上出現(xiàn)了板塊化的失綠，說(shuō)明整合了Cas9和crRNA片段的pCAPE1和pCAPE2能夠侵染煙草，并能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。對(duì)失綠的煙草葉片區(qū)域取樣后，提取基因組DNA，

5、設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增煙草PDS基因區(qū)域，擴(kuò)增后的片段連接到pGEMTeasy載體，通過(guò)對(duì)基因組測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，PDS基因未能發(fā)生編輯。分析后發(fā)現(xiàn)所用的煙草品種Samsun的PDS基因與所設(shè)計(jì)的CRISPRcas9系統(tǒng)的Target序列有幾個(gè)堿基的差異。3、獲取煙草的配子特異表達(dá)基因NtDMC1，將其構(gòu)建進(jìn)表達(dá)載體中，利用Gateway技術(shù)將Cas9蛋白構(gòu)建到該載體中，獲得pH7WG：NtDMC1：Cas9載體。論文構(gòu)建PEBV介導(dǎo)的CRISPR

6、Cas9基因組編輯的載體pCAPE2:Cas9crRNA和PEBV介導(dǎo)的crRNA表達(dá)的載體pCAPE2:crRNA，獲得了遍在表達(dá)Cas9蛋白的煙草轉(zhuǎn)基因系，克隆煙草配子特異表達(dá)基因NtDMC1的啟動(dòng)子，構(gòu)建了Cas9配子特異表達(dá)載體pH7WG：NtDMC1：Cas9，證明了PEBV能夠介導(dǎo)crRNA和Cas9蛋白能在煙草中擴(kuò)增，為RNA病毒介導(dǎo)CRISPRCas9系統(tǒng)在植物基因組編輯中的應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：基因組編輯，CRIS