嗜肺軍團菌、甲型H1N1流感病毒熒光定量檢測技術研究.pdf

1、目的：建立對嗜肺軍團菌、甲型H1N1流感病毒快速、特異、靈敏的檢測方法，為臨床診斷、環(huán)境安全監(jiān)測和進出口檢驗檢疫等提供有效地檢測手段。
　　 方法：根據(jù)國內(nèi)唯一探針專利技術——復合探針技術原理，找到病原微生物的特異基因序列，并以此為靶序列進行特異引物和探針設計合成，對相應病原微生物進行實時熒光定量檢測，并對鎂離子濃度、引物濃度、退火溫度、熒光探針及淬滅探針用量等影響熒光定量擴增檢測的各因素進行系統(tǒng)優(yōu)化。
　　 結果：為獲

2、得嗜肺軍團菌實時熒光定量PCR檢測的陽性對照，我們構建了含mip基因108bp目的擴增片段的重組質(zhì)粒，經(jīng)驗證實際應用效果良好。建立的實時熒光定量PCR檢測方法對嗜肺軍團菌檢測有陽性結果，對非嗜肺軍團菌檢測有陰性結果。為提高擴增效率及靈敏度對反應體系及條件進行優(yōu)化，確定甲酰胺含量為3％，Mg2+濃度5 mmol/L，上下游引物0.5μmol/L，熒光探針0.2μmol/L，淬滅探針0.4μmol/L，53℃退火30s。采用該方法最低可檢測

3、到102CFU/ml細菌，在模擬污水檢測中，檢測靈敏度為102 CFU/ml。
　　 為獲得甲型H1N1流感病毒實時熒光定量PCR檢測的陽性對照，我們構建了含HA基因540bp目的擴增片段的體外轉錄RNA，經(jīng)驗證使用效果良好。實時熒光RT-PCR定量檢測反應體系中，最佳Mg2+濃度為4.0 mmol/L，反轉錄酶混合物為50U/μl superscriptⅢ與2.0U/μl Taq酶混合，50℃反轉錄20 min，52℃退火20

4、 s。該方法對22株非甲型H1N1流感病毒株進行檢測結果均為陰性，對4株甲型H1N1流感病毒樣品檢測結果均為陽性，經(jīng)重復性檢測CV％值小于5％。最低可以檢出10 copies/μl體外轉錄RNA。在對38份臨床樣本的檢測中，符合率為100％。并篩選出一種效果優(yōu)良、價格低廉的核酸提取試劑盒。
　　 結論：復合探針熒光定量檢測技術能有高效、特異、靈敏地定量檢測出嗜肺軍團菌及甲型H1N1流感病毒，本研究建立的檢測方法對疾病快速診斷、環(huán)