羥基紅花黃色素A對缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制探討.pdf

1、目的：缺血性心臟病是嚴(yán)重危害人類生命與健康的常見病和多發(fā)病，其關(guān)鍵問題是氧的供需不平衡導(dǎo)致的心肌缺氧及由血流障礙導(dǎo)致的營養(yǎng)供應(yīng)不足和代謝產(chǎn)物堆積引發(fā)的心肌病變。因此，改善心肌缺血缺氧狀態(tài)，減輕對心肌細(xì)胞的損傷具有重要治療意義。 羥基紅花黃色素A(hydroxysaffior yellow A，HSYA)是從傳統(tǒng)中藥紅花中提取的單體化合物。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為紅花活血祛瘀消腫，通暢血脈，消腫止痛，臨床上多用于冠心病，肺心病，腦血栓等疾病的

2、治療。從紅花中提取的水溶性有效成分紅花黃色素(SY)也具有擴(kuò)張血管、改善心肌供血、抑制血小板聚集、抑制血栓形成、抗氧化等多種藥理作用。近年來發(fā)現(xiàn)在SY中HSYA含量較高，是發(fā)揮上述藥理作用的有效單體成分。許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)HSYA可以對抗自由基和血小板活化因子，具有抗腦缺血和神經(jīng)保護(hù)的作用。但關(guān)于HSYA對心臟的直接作用研究甚少。本實(shí)驗(yàn)建立體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺氧模型觀察HSYA對心肌的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。 方法：取1～3 d

3、齡Wistar大鼠，無菌條件下摘取心臟，剪碎組織，加入0.125﹪胰蛋白酶溶液、37℃消化4～6次，每次消化的上清液以含20﹪新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，靜置后將上清液消化產(chǎn)物以1000r/min離心10min，棄去上清液后將細(xì)胞重懸于含20﹪小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中差速培養(yǎng)兩次，以1×10<'5>/ml的密度接種于培養(yǎng)板，置37℃、5﹪CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換培養(yǎng)液并加入0.5μg/ml絲裂霉素抑制成纖維細(xì)胞生

4、長，48h后棄去絲裂霉素，以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24h換液一次。 (1) HSYA對缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用：將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照、缺氧損傷、HSYA保護(hù)(共設(shè)1×10<'-6>mol/L，1×10<'-7>mol/L，1×10<'-8>mol/L,1x10<'-9>mol/L和1×10<'-10>mol/L五組)以及地爾硫卓1×10<'-7>mol/L組，同時設(shè)1×10<'-6>mol/L HSYA正常對照組，以觀察本

5、實(shí)驗(yàn)中最高濃度的藥物是否會對正常心肌細(xì)胞產(chǎn)生影響。缺氧損傷組以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2h后以無糖Hank's液置換正常培養(yǎng)基，置于自制缺氧盒中通以高純氮?dú)?99﹪)并密閉培養(yǎng)3h，制備缺氧模型。各藥物保護(hù)組先以含不同濃度HSYA或地爾硫卓的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2h，再更換為含藥的無糖Hank's液，置于缺氧盒中同樣培養(yǎng)3h。1×10<'-6>mol/L HSYA組只加入含藥物的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)5h。觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，計(jì)數(shù)細(xì)胞搏動頻率，測定心肌細(xì)胞

6、存活率、細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性、細(xì)胞內(nèi)的丙二醛(MDA)濃度以及ATP酶活性。 (2)HSYA保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞的作用機(jī)制探討：將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照、缺氧損傷、HSYA．1×10<'-7>mol/L組、HSYA 1×10<'-8>mol/L組及地爾硫卓1×10<'-7>mol/L組。各組細(xì)胞處理同(1)。采用FURA2/AM熒光探針法測定各組細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度，RT-PCR法觀察心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)

7、和質(zhì)膜鈣離子ATP酶的表達(dá)水平。 結(jié)果：與缺氧損傷組比較，1×10<'-7>mol/L和1×10<'-8>mol/L HSYA組心肌細(xì)胞仍存在規(guī)律性搏動，細(xì)胞存活率顯著升高(p<0.01)，細(xì)胞培養(yǎng)液中UDH漏出和心肌細(xì)胞內(nèi)MDA的含量明顯降低(p<0.05，p<0.01)，而細(xì)胞內(nèi)ATP酶的活性較缺氧損傷組顯著增高(P<0.01)。細(xì)胞內(nèi)游離ca<'2+>濃度測定結(jié)果表明，此兩種濃度的HSYA．可明顯降低心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca<'2

8、+>濃度(p<0.01)，與地爾硫卓組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，HSYA能增加心肌細(xì)胞質(zhì)膜和肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶的表達(dá)(p<0.05，p<0.01)。 結(jié)論：1×10<'-7>mol/L和1×10<'-8>mol/L的HSYA對缺氧心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，表現(xiàn)為減輕缺氧所致的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷，減少細(xì)胞內(nèi)LDH漏出，阻上LMDA生成，提高細(xì)胞ATP酶活性，從而提高細(xì)胞存活率。此保護(hù)作用與增加心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)和質(zhì)膜鈣