基于L-精氨酸骨架的氨肽酶N抑制劑的設(shè)計、合成及活性研究.pdf

1、氨肽酶N(APN)是一類膜型鋅離子依賴性的外肽酶，在很多組織如小腸、腎、肝以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有廣泛分布。該酶參與了營養(yǎng)素的最終水解和生物活性分子如腦啡肽和內(nèi)啡肽的降解失活。另外，氨肽酶N也是冠狀病毒的受體，并參與了抗原遞呈的過程。更為重要的是，Saiko等人確定氨肽酶N在腫瘤細(xì)胞表面高水平表達，被稱作腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物或相關(guān)抗原CD13。它在腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和新生血管的生成等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此氨肽酶N成為抗腫瘤藥物研究的

2、一個重要靶點。
　　 到目前為止人源氨肽酶N的晶體結(jié)構(gòu)未見報道。2006年Kiyoshi等人報道了大腸桿菌氨肽酶N(eAPN)以及eAPN與其特異性抑制劑Bestatin共結(jié)晶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。eAPN的晶體結(jié)構(gòu)表明氨肽酶N活性區(qū)域至少包含有一個陰離子結(jié)合位點和三個疏水性口袋。三個疏水性口袋分別是位于鋅離子左側(cè)的S1口袋和右側(cè)的S1'和S2'口袋。這為氨肽酶N抑制劑的合理藥物設(shè)計奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究以氨肽酶N為靶點

3、，基于Bestatin與eAPN作用模式，通過計算機輔助藥物設(shè)計，構(gòu)建出抑制劑的藥效團模型，然后結(jié)合文獻調(diào)研和本課題組已有的研究成果確定以L-精氨酸為母體骨架。在構(gòu)建的L-精氨酸母核的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，根據(jù)eAPN的三維結(jié)構(gòu)要求，將其側(cè)鏈進行結(jié)構(gòu)衍生化。在合成目標(biāo)化合物之前，首先利用SYBYL7.0中的FlexX軟件對所設(shè)計的化合物進行了對接打分，結(jié)果顯示大部分化合物分值都接近于甚至超過陽性對照Bestatin。這說明了我們設(shè)計思路的合理性，

4、為我們的研究提供了理論依據(jù)。
　　 本研究的合成工作以L-精氨酸為起始原料，首先將L-精氨酸的胍基用硝基保護，再將其羧基進行甲酯化保護得到關(guān)鍵中間體，然后將中間體與芳酰氯，芳磺酰氯，芳酸，Boc保護的氨基酸或者各種類二肽縮合，最后將羧酸甲酯轉(zhuǎn)化成異羥肟酸，脫Boc保護基得到兩個系列的目標(biāo)化合物，即類二肽化合物(A系列)和類三肽化合物(B系列)。
　　 本文共設(shè)計、合成了107個目標(biāo)化合物，并通過紅外光譜、核磁共振氫譜、電

5、噴霧質(zhì)譜，高分辨質(zhì)譜等方法對化合物結(jié)構(gòu)進行了確證。經(jīng)文獻檢索證明，所合成的目標(biāo)化合物均為新型化合物，未見報道。對目標(biāo)化合物進行了體外抑酶實驗、體外抑制HL-60、K562、ES-2、A549、PLC及H7402細(xì)胞增殖實驗，體內(nèi)動物抑瘤實驗等，以期篩選出高活性的氨肽酶N抑制劑。
　　 體外抑酶實驗結(jié)果顯示，B系列化合物相對于A系列化合物活性有所提高，且兩個系列的化合物對APN的抑制活性都優(yōu)于MMP-2。A系列中的A18和A21活

6、性較好，IC50達到了5.3和5.1μM(Bestatin，IC50=3.1μM)。B系列化合物中B47，B50和B52的IC50分別達到了64.8，53.4和59.0μM，接近于陽性對照Bestatin(IC50=51.8μM)。
　　 MTT法體外細(xì)胞實驗測定了體外抑酶活性較好的11個化合物對高表達APN/CD13的HL-60、ES-2、A549、PLC細(xì)胞以及低表達APN的K562、H7402細(xì)胞的增殖抑制活性，實驗結(jié)果表

7、明我們的化合物對APN高表達的細(xì)胞都有較好的抑制作用，對于APN低表達的H7402細(xì)胞抑制作用比較差，但是對另外一種APN低表達的細(xì)胞K562的抑制活性卻比較好，其原因還有待于進一步的研究分析?；衔顰22對于六種腫瘤細(xì)胞都顯示出了很好的活性，可以對其進行進一步的體內(nèi)動物實驗研究。
　　 體內(nèi)動物抑瘤實驗選取了體外抗細(xì)胞增殖作用好的A22，B46，BS0和B52四個化合物進行研究，實驗結(jié)果表明化合物A22和BS0能明顯減少荷肝癌

8、H22小鼠的肺部結(jié)節(jié)數(shù)目，即能明顯抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，抑制率也超過了陽性對照藥Bestatin，分別達到了61.50％和71.39％(Bestatin的抑制率為58.04％)。
　　 本文在所有化合物活性實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用計算機軟件進行了初步定量構(gòu)效關(guān)系的研究。構(gòu)建了QSAR模型，對于指導(dǎo)以后同類化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化有一定的指導(dǎo)作用。
　　 本研究的主要創(chuàng)新點是：①基于eAPN的晶體結(jié)構(gòu)及Bestatin與eAPN的作用模