轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA的HER2靶向PEG化凍干免疫脂質(zhì)體的制劑學(xué)研究.pdf

1、人類的許多疾病都與基因的過度表達(dá)相關(guān)，RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，通過RNA干擾技術(shù)沉默相關(guān)基因的表達(dá)可以治療包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病[1]。腫瘤的基因治療目前面臨的一個(gè)非常重要問題是如何將小干擾RNA（siRNA）高效地轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞并有效發(fā)揮基因沉默效率。siRNA較易降解，而且由于細(xì)胞膜同性電荷排斥作用和腎過濾作用，使得siRNA必須借助載體運(yùn)輸才能有效的轉(zhuǎn)染入腫瘤

2、細(xì)胞內(nèi)；雖然載體能提高siRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率，然而siRNA/載體復(fù)合物仍然面臨網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）吞噬、從血管中外滲進(jìn)入腫瘤組織、穿過腫瘤細(xì)胞膜、siRNA內(nèi)涵體釋放等一系列障礙和問題[2-5]。聚乙二醇（PEG）化免疫脂質(zhì)體作為一種安全有效的siRNA載體，對(duì)于上述問題的解決極具潛力。
　　 課題組前期[6]對(duì)DC-Chol/DOPE陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制劑學(xué)研究已經(jīng)得出一系列結(jié)果：對(duì)于DC-Chol/DOPE陽(yáng)離子脂質(zhì)體

3、來(lái)說，在DC-Chol/DOPE摩爾比例為1時(shí)，siRNA的轉(zhuǎn)染效率最高，隨著DC-Chol/DOPE陽(yáng)離子脂質(zhì)體中的PEG含量的增加，siRNA的轉(zhuǎn)染效率呈下降趨勢(shì)。本課題正是基于前期研究結(jié)果而開展的。本研究繼續(xù)對(duì)DC-Chol/DOPE陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)行PEG化修飾、抗HER2單克隆抗體Fab’片段（Anti-HER2 Fab’）的靶向修飾、冷凍干燥等處理，旨在得到一種對(duì)siRNA保護(hù)性更強(qiáng)、腫瘤靶向性更好、內(nèi)涵體釋放更多、基因沉默效

4、率更高的siRNA載體。首先，我們制備得到PEG化的DC-Chol/DOPE陽(yáng)離子脂質(zhì)體（簡(jiǎn)稱PL），然后修飾Anti-HER2Fab’得PEG化的免疫脂質(zhì)體（簡(jiǎn)稱PIL），最后通過凍干制得PEG化凍干免疫脂質(zhì)體（簡(jiǎn)稱LPIL），最后，我們對(duì)PIL、LPIL及其siRNA復(fù)合物進(jìn)行一系列的制劑學(xué)研究和體外活性研究。
　　 本文主要對(duì)PIL，和LPIL的粒徑、zeta電位、Fab’連接效率、siRNA包封率、siRNA血清穩(wěn)定性等

5、指標(biāo)進(jìn)行考察。不同PEG化的PIL，或PL的粒徑均為130～150 nm，不同PEG化的LPIL水化后粒徑增大10～20 nm。當(dāng)DC-Chol/siRNA（w/w）的比例為5/1左右時(shí)，脂質(zhì)體（包括PL、PIL、LPL，和LPIL）/siRNA復(fù)合物的粒徑達(dá)到峰值；在該比例為10/1時(shí)，脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物zeta電位出現(xiàn)拐點(diǎn)。SDS-PAGE證實(shí)了Anti-HER2 Fab’確實(shí)連接在LPIL上，連接效率約為20％。我們利用Qu

6、ant-iTTMRiboGreen（）法測(cè)定了PIL和LPIL的siRNA包封率，結(jié)果顯示當(dāng)DC-Chol/siRNA的質(zhì)量比較?。?或5）時(shí)，2.5 mol％PEG的LPIL的包封率明顯高于2.5％PEG的PIL（P<0.01）。瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)：2.5 mol％PEG的LPIL或LPL對(duì)siRNA的保護(hù)較PIL和PL好。
　　 在體外實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)LPIL的靶向性、不同PEG化程度對(duì)LPIL的基因沉默效率影響以及2.5 m

7、ol％PEG的LPIL的體外活性進(jìn)行研究。共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察結(jié)果表明：LPIL能特異性靶向高表達(dá)HER2抗原的SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞并被內(nèi)吞：流式細(xì)胞儀（FCM）結(jié)果證實(shí)凍干能顯著提高脂質(zhì)體的基因沉默效率，而且含2.5mol％PEG的LPIL具有最佳的基因沉默效率；最后我們利用2.5 mol％PEG的LPIL轉(zhuǎn)導(dǎo)與腫瘤細(xì)胞遷移有關(guān)的Anti-RhoA siRNA，結(jié)果表明2.5 mol％PEG的LPIL能特異性沉默SK-BR