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1、人類的許多疾病都與基因的過度表達(dá)相關(guān),RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制,通過RNA干擾技術(shù)沉默相關(guān)基因的表達(dá)可以治療包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病[1]。腫瘤的基因治療目前面臨的一個(gè)非常重要問題是如何將小干擾RNA(siRNA)高效地轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞并有效發(fā)揮基因沉默效率。siRNA較易降解,而且由于細(xì)胞膜同性電荷排斥作用和腎過濾作用,使得siRNA必須借助載體運(yùn)輸才能有效的轉(zhuǎn)染入腫瘤
2、細(xì)胞內(nèi);雖然載體能提高siRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率,然而siRNA/載體復(fù)合物仍然面臨網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吞噬、從血管中外滲進(jìn)入腫瘤組織、穿過腫瘤細(xì)胞膜、siRNA內(nèi)涵體釋放等一系列障礙和問題[2-5]。聚乙二醇(PEG)化免疫脂質(zhì)體作為一種安全有效的siRNA載體,對(duì)于上述問題的解決極具潛力。
課題組前期[6]對(duì)DC-Chol/DOPE陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制劑學(xué)研究已經(jīng)得出一系列結(jié)果:對(duì)于DC-Chol/DOPE陽(yáng)離子脂質(zhì)體
3、來(lái)說,在DC-Chol/DOPE摩爾比例為1時(shí),siRNA的轉(zhuǎn)染效率最高,隨著DC-Chol/DOPE陽(yáng)離子脂質(zhì)體中的PEG含量的增加,siRNA的轉(zhuǎn)染效率呈下降趨勢(shì)。本課題正是基于前期研究結(jié)果而開展的。本研究繼續(xù)對(duì)DC-Chol/DOPE陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)行PEG化修飾、抗HER2單克隆抗體Fab’片段(Anti-HER2 Fab’)的靶向修飾、冷凍干燥等處理,旨在得到一種對(duì)siRNA保護(hù)性更強(qiáng)、腫瘤靶向性更好、內(nèi)涵體釋放更多、基因沉默效
4、率更高的siRNA載體。首先,我們制備得到PEG化的DC-Chol/DOPE陽(yáng)離子脂質(zhì)體(簡(jiǎn)稱PL),然后修飾Anti-HER2Fab’得PEG化的免疫脂質(zhì)體(簡(jiǎn)稱PIL),最后通過凍干制得PEG化凍干免疫脂質(zhì)體(簡(jiǎn)稱LPIL),最后,我們對(duì)PIL、LPIL及其siRNA復(fù)合物進(jìn)行一系列的制劑學(xué)研究和體外活性研究。
本文主要對(duì)PIL,和LPIL的粒徑、zeta電位、Fab’連接效率、siRNA包封率、siRNA血清穩(wěn)定性等
5、指標(biāo)進(jìn)行考察。不同PEG化的PIL,或PL的粒徑均為130~150 nm,不同PEG化的LPIL水化后粒徑增大10~20 nm。當(dāng)DC-Chol/siRNA(w/w)的比例為5/1左右時(shí),脂質(zhì)體(包括PL、PIL、LPL,和LPIL)/siRNA復(fù)合物的粒徑達(dá)到峰值;在該比例為10/1時(shí),脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物zeta電位出現(xiàn)拐點(diǎn)。SDS-PAGE證實(shí)了Anti-HER2 Fab’確實(shí)連接在LPIL上,連接效率約為20%。我們利用Qu
6、ant-iTTMRiboGreen()法測(cè)定了PIL和LPIL的siRNA包封率,結(jié)果顯示當(dāng)DC-Chol/siRNA的質(zhì)量比較?。?或5)時(shí),2.5 mol%PEG的LPIL的包封率明顯高于2.5%PEG的PIL(P<0.01)。瓊脂糖凝膠電泳證實(shí):2.5 mol%PEG的LPIL或LPL對(duì)siRNA的保護(hù)較PIL和PL好。
在體外實(shí)驗(yàn)中,我們對(duì)LPIL的靶向性、不同PEG化程度對(duì)LPIL的基因沉默效率影響以及2.5 m
7、ol%PEG的LPIL的體外活性進(jìn)行研究。共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察結(jié)果表明:LPIL能特異性靶向高表達(dá)HER2抗原的SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞并被內(nèi)吞:流式細(xì)胞儀(FCM)結(jié)果證實(shí)凍干能顯著提高脂質(zhì)體的基因沉默效率,而且含2.5mol%PEG的LPIL具有最佳的基因沉默效率;最后我們利用2.5 mol%PEG的LPIL轉(zhuǎn)導(dǎo)與腫瘤細(xì)胞遷移有關(guān)的Anti-RhoA siRNA,結(jié)果表明2.5 mol%PEG的LPIL能特異性沉默SK-BR
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