基于免疫脂質(zhì)體的生物傳感器在體外診斷中研究及其應(yīng)用.pdf

1、體外診斷(In vitro diagnosis，IVD)是一種在人體之外檢驗(yàn)樣本（血液、體液、組織）而進(jìn)行疾病或身體功能的診斷方法。生物傳感器(Biosensor)是在生命科學(xué)和信息科學(xué)之間發(fā)展起來的一類特殊傳感器，在多種學(xué)科的融合和交叉下形成的，包括醫(yī)學(xué)、納米技術(shù)、信息學(xué)和化學(xué)等等，在食品檢測(cè)、活體成像、臨床應(yīng)用上有巨大的作用，是目前國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)研究。目前臨床上對(duì)于各類標(biāo)記物的檢測(cè)方法普遍存在操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、需要特殊場(chǎng)地、大

2、型設(shè)備及專業(yè)人員等因素制約，因此開發(fā)高靈敏度、簡(jiǎn)便、快速、適用于復(fù)雜環(huán)境并利于臨床推廣的生物傳感技術(shù)迫在眉睫。蛋白質(zhì)是生物體中必不可少的生物分子，涉及廣泛的生物學(xué)功能。其異常表達(dá)是常與疾病聯(lián)系在一起，對(duì)于疾病的診斷、治療和預(yù)后有著重要的意義。在蛋白質(zhì)檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)微量、動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)且快速，是目前廣大科研工作人員的關(guān)注點(diǎn)。納米技術(shù)在生物領(lǐng)域形成了納米生物技術(shù)，將納米材料應(yīng)用于生物傳感器可以很大程度的提高傳感器的性能。脂質(zhì)體作為新型納米診斷顆粒

3、，既可以鏈接不同的配體如抗原、抗體、生物素、羧基等，又可以包封不同的標(biāo)記物，檢測(cè)模式多種多樣?？梢宰鳛樾盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號(hào)轉(zhuǎn)化、信號(hào)放大的良好載體，具有廣泛的應(yīng)用前景，在高靈敏度和多種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用上有其優(yōu)越性。本論文以臨床常用肝癌、胰腺癌及炎癥生物標(biāo)記物為蛋白檢測(cè)模型，與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、手持熒光檢測(cè)儀及微流控芯片等技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了一系列基于免疫脂質(zhì)

4、體納米顆粒的生物傳感器，并應(yīng)用與臨床標(biāo)本，大大提高了檢測(cè)靈敏度及即時(shí)檢測(cè)(Point-of-care testing，POCT)技術(shù)。
　　第一部分 基于生物熒光脂質(zhì)體和便攜式ATP熒光檢測(cè)儀在肝癌診斷中的應(yīng)用
　　本部分，我們研發(fā)了一種超靈敏的基于磁性-生物熒光脂質(zhì)體的生物傳感器，使用便攜式三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)熒光檢測(cè)儀用于血液中蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的POCT檢測(cè)。在這項(xiàng)研究中，我

5、們使用甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP，肝癌相關(guān)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物)作為模型蛋白。羧基磁珠偶聯(lián)單克隆抗體捕獲樣本中的靶蛋白，隨后與標(biāo)記有生物熒光脂質(zhì)體的多克隆抗體結(jié)合，形成磁珠-靶蛋白-脂質(zhì)體復(fù)合物。脂質(zhì)體破膜后，包裹在內(nèi)腔的ATP釋放，可用便攜式熒光儀進(jìn)行讀數(shù)。在此過程中，我們使用便攜式磁珠分離筆來簡(jiǎn)化步驟。相對(duì)光單位(Relative light units,RLUs)與AFP濃度在0.05和1000ng/mL之

6、間呈線性相關(guān)，最低檢測(cè)限(Limit of detection，LOD)為0.01ng/mL。當(dāng)RLUs大于300，即AFP濃度大于25ng/mL時(shí)即有診斷意義。我們稱這種基于生物熒光脂質(zhì)體和便攜式ATP熒光的檢測(cè)技術(shù)為L(zhǎng)BM(The bioluminescent nanoliposomes conjugated to magnetic particles)。此方法對(duì)AFP顯示出高度特異性，在25ng/mL濃度下與其他蛋白質(zhì)無反應(yīng)。通過

7、LBM方法對(duì)40個(gè)臨床樣品(20例AFP陽性和20例AFP陰性)進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用測(cè)試，結(jié)果與羅氏電化學(xué)發(fā)光測(cè)定的結(jié)果一致，相對(duì)偏差小于10％。這種LBM技術(shù)在血液中的成功應(yīng)用為其他生物標(biāo)志物檢測(cè)提供了的新的思路，也顯示出了其在臨床診斷的POCT中的巨大潛力。
　　第二部分 基于生物素化脂質(zhì)體和LAMP的生物傳感器在胰腺癌診斷中的應(yīng)用
　　隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展和痕量蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的不斷發(fā)現(xiàn)，準(zhǔn)確定量低豐度蛋白，特別是尿液中的蛋白

8、質(zhì)對(duì)臨床診斷具有重要意義。在這部分，我們研發(fā)了一種新的基于納米生物素脂質(zhì)體結(jié)合LAMP的超靈敏檢測(cè)蛋白標(biāo)記物技術(shù)。選擇REG1A（一種可用于胰腺導(dǎo)管腺癌診斷的尿生物標(biāo)志物）為蛋白模型。我們稱這種檢測(cè)方法為L(zhǎng)I-LAMP(Nano-biotinylated liposome-based loop-mediated isothermal amplification)。此方法將DNA作為報(bào)告分子，包封于三代脂質(zhì)體內(nèi)，并在表面標(biāo)記生物素化配體，

9、結(jié)合核酸擴(kuò)增產(chǎn)生三倍信號(hào)放大。此方法用于REG1A診斷特異性高，線性檢測(cè)范圍為1fg/mL至1μg/mL，LOD為1fg/mL，蛋白回收率為89％-130％。實(shí)際樣品應(yīng)用于經(jīng)典ELISA試劑盒方法結(jié)果一致，相對(duì)偏差不超過10％。LI-LAMP使用生物素化脂質(zhì)體，可將保存期延長(zhǎng)，通過生物素-親和素橋聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)一步信號(hào)放大，并可以很好地與現(xiàn)有的商業(yè)試劑盒對(duì)接，其超高的靈敏度為其他低豐度的蛋白標(biāo)志物提供了可行的檢測(cè)方法。
　　第三部分 微

10、流控芯片和量子點(diǎn)脂質(zhì)體用于炎癥標(biāo)志物定量的iPOCT檢測(cè)
　　本部分，我們采用脂質(zhì)體與量子點(diǎn)相結(jié)合，將油性量子點(diǎn)變?yōu)樗苄缘募{米量子點(diǎn)脂質(zhì)體微球，對(duì)蛋白標(biāo)志物進(jìn)行特異性的標(biāo)記及識(shí)別，在微流控芯片上iPOCT實(shí)現(xiàn)快速、靈敏的診斷。我們命名此種方法為L(zhǎng)QC(Liposome encapsulated quantum dots combined with microfluidic chip for iPOCT)。在這項(xiàng)研究中，我們使用降

11、鈣素原（Procalcitonin，PCT，炎癥蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物）作為模型蛋白。將多克隆抗體和羊抗鼠抗體按照一定的濃度和體積鋪設(shè)于微流控芯片以形成檢測(cè)線和控制線，結(jié)合區(qū)預(yù)先鋪設(shè)與單克隆抗體偶聯(lián)的量子點(diǎn)脂質(zhì)體，將待測(cè)樣本加樣到結(jié)合區(qū)后，在毛細(xì)力的驅(qū)動(dòng)下，進(jìn)入反應(yīng)區(qū)。結(jié)合自行研制的便攜紫外激發(fā)設(shè)備和手機(jī)應(yīng)用程序進(jìn)行讀數(shù)分析，并對(duì)可行性進(jìn)行驗(yàn)證。RGB傳感器檢測(cè)可知，G通道和PCT濃度在0-10ng/mL之間呈線性，LOD為0.5ng/mL。