茄子花青素生物合成關(guān)鍵MYB轉(zhuǎn)錄因子的篩選及克隆.pdf

1、R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子（MYB transcription factor）是植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子中最大的家族之一。R2R3MYB轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝及非生物脅迫等生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用。隨多種植物全基因組測(cè)序的完成，多個(gè)物種的R2R3MYB家族已經(jīng)被鑒別出來(lái)。目前，對(duì)于R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子在花青素生物合成過(guò)程中的功能研究，大多集中在擬南芥、水稻、大豆等模式植物中，在茄子中研究相對(duì)較少。茄皮具有紫色、白色、紅色和橙色等明顯

2、的顏色農(nóng)藝性狀，為研究花青素的生物合成提供了基礎(chǔ)。茄子基因組測(cè)序的完成，為茄子R2R3MYB家族的鑒定和花青素生物合成相關(guān)R2R3MYB基因的挖掘提供了有力條件。本文利用生物信息學(xué)方法對(duì)茄子R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了鑒別，并結(jié)合茄皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，篩選并克隆了一個(gè)與花青素生物合成相關(guān)的基因SmMYB6，為茄子遺傳改良和創(chuàng)造高花青素含量的茄子新種質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用126個(gè)擬南芥R2R3MYB蛋白序

3、列及隱馬爾科夫模型（Hidden Markow Model）的識(shí)別技術(shù)，在茄子基因網(wǎng)站（http://eggplant.kazusa.or.jp/）中篩選出73個(gè)茄子R2R3MYB基因。⑵為了對(duì)茄子R2R3MYB全基因家族進(jìn)行研究，分析了茄子R2R3MYB全基因家族與擬南芥R2R3MYB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化情況；茄子與擬南芥、番茄、黃瓜、水稻、大豆、楊樹(shù)、葡萄和蘋(píng)果R2R3MYB蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化情況；N端R2R3功能域的保守性及茄子 R2R3M

4、YB基因內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)特征。⑶為了研究茄子 R2R3MYB基因在花青素生物合成中的調(diào)控作用，從73個(gè)R2R3MYB基因中篩選出9個(gè)與花青素生物合成相關(guān)的茄子R2R3MYB基因，利用qRT-PCR對(duì)其在光質(zhì)處理下及不同茄子組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，LED紅藍(lán)組合1:1處理下，SmMYB4、SmMYB6、SmMYB13、SmMYB21和SmMYB22的相對(duì)表達(dá)水平比單獨(dú)LED藍(lán)光或紅光處理下有所升高，且 SmMYB2、Sm

5、MYB6、SmMYB13和SmMYB22在紅藍(lán)組合光1:1處理下，其表達(dá)量高于LED白光處理，SmMYB13和SmMYB22與LED白光處理差異顯著。通過(guò)分析這些基因茄子不同顏色組織中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，與白皮茄子相比，紫皮茄子莖、葉、花瓣和茄皮中SmMYB6表達(dá)量顯著升高，而花萼中SmMYB4、果肉和茄皮中SmMYB1和SmMYB13的表達(dá)量也顯著升高。以上結(jié)果表明SmMYB6在紫色組織中表達(dá)量較高。⑷利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)

6、紫色茄皮和白色茄皮的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)基因組對(duì)比及組裝，得到89823條轉(zhuǎn)錄本，其中已知轉(zhuǎn)錄本86095條，新轉(zhuǎn)錄本3728條。⑸對(duì)轉(zhuǎn)錄本中的表達(dá)差異基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并對(duì)差異表達(dá)進(jìn)行GO、KEGG功能富集和InterProScan功能注釋。在GO分類體系中，475條基因歸為參與生物學(xué)過(guò)程，496條基因歸為分子功能，246條基因歸為細(xì)胞組分。KEGG通路中共有45個(gè)基因與6條類黃酮生物合成途徑相關(guān)。⑹通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到與茄子花青素

7、生物合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子3個(gè)和結(jié)構(gòu)基因8個(gè)。利用qRT-PCR進(jìn)一步分析可知，SmMYB6在紫色茄皮中的表達(dá)顯著高于SmMYB10和SmMYB18；結(jié)構(gòu)基因SmF3'5'H、SmDFR、SmF3GT、Sm5GT在紫色茄皮中表達(dá)量較高。綜合生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可知，SmMYB6是參與茄子花青素生物合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。⑺克隆到SmMYB6 CDS全長(zhǎng)771 bp；并利用一步法將SmMYB6 CDS連接到植物表達(dá)載體pRII和瞬時(shí)表達(dá)載體