光信號(hào)誘導(dǎo)茄子花青素合成的分子機(jī)制研究.pdf

1、花青素是類黃酮合成途徑的分支，光是影響花青素生物合成的最為重要的環(huán)境因子。茄子果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，富含花青素。在實(shí)際生產(chǎn)中會(huì)遇到弱光條件下茄子果皮著色不良，造成品質(zhì)下降的現(xiàn)象。由于傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的局限，對(duì)光調(diào)控茄子果實(shí)著色機(jī)制的研究還很缺乏。為此，本研究以光敏型茄子‘藍(lán)山禾線茄’為研究材料，通過套袋處理結(jié)合RNA-seq和iTRAQ技術(shù)從mRNA水平和蛋白水平分析了光信號(hào)誘導(dǎo)下茄子的響應(yīng)機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　1)通過超高效液相色譜

2、-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS)技術(shù)鑒定了‘藍(lán)山禾線茄’中的2種花青素組分：飛燕草素-3-[4-(順式-香豆酰)-鼠李糖-(1—6)-吡喃葡萄糖苷]-5-吡喃葡萄糖苷、飛燕草素-3-[4-(反式-香豆酰)-鼠李糖-(1—6)-吡喃葡萄糖苷]-5-吡喃葡萄糖苷。光信號(hào)誘導(dǎo)下茄子果皮花青素的含量與時(shí)間的關(guān)系曲線呈現(xiàn)“ S”型，曲線的拐點(diǎn)時(shí)間為5.191 d，由此確定了進(jìn)行RNA-seq和 iTRAQ樣品的取樣時(shí)間點(diǎn)（0d、5d、12 d)

3、。
　　2)通過分析RNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在5 d vs0 d中有784個(gè) DEGs，G O功能富集分析將它們分為30個(gè)功能組別；KEGG Pathway分析獲得43條顯著性富集的通路，包括類黃酮合成通路。在12dvs5d中有516個(gè)DEGs; GO功能富集分析將它們分為27個(gè)功能組別；KEGG Pathway分析獲得29條顯著性富集的通路，同樣包括類黃酮合成通路。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)注釋為花青素合成結(jié)構(gòu)基因的CHS、CHI、F3H、

4、F3，5，H、DFR、ANS和調(diào)節(jié)基因MYB1的表達(dá)模式均為從0d到5 d上調(diào)表達(dá)，5 d到12 d下調(diào)表達(dá)，在 mRNA水平解釋了光調(diào)控茄子花青素合成的可能機(jī)理。
　　3)通過分析iTRAQ數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在5dvs0d中有293個(gè)DEPs; GO功能富集分析將它們分為37個(gè)功能組別；KEGG Pathway分析獲得23條顯著性富集的通路，與RNA-seq不同的是，DEPs沒有顯著富集到類黃酮合成通路。在12dvs5 d中有228個(gè)

5、DEPs；G O功能富集分析將它們分為34個(gè)功能組別；KEGG Pathway分析獲得11條顯著性富集的通路，同樣DEPs沒有顯著富集到類黃酮合成通路。進(jìn)一步分析表明在DEPs中僅發(fā)現(xiàn)C H I和 F3H。
　　4)將轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分別發(fā)現(xiàn)有52個(gè)（5dvs0d)和39個(gè)（12 d vs5 d)關(guān)聯(lián)差異蛋白。在5 d vs0 d的比較中，CHS、F3H、F3’5’H、DFR、ANS的蛋白表達(dá)無(wú)差異，基因表達(dá)有

6、差異，CHI的蛋白與基因表達(dá)均有差異。在12 d v s5 d的比較中，CHS、F3’5’H、DFR、ANS的蛋白表達(dá)無(wú)差異，基因表達(dá)有差異；CHI、F3H的蛋白與基因表達(dá)均有差異。結(jié)果表明花青素合成結(jié)構(gòu)基因的蛋白表達(dá)模式與mRNA不完全一致。
　　5)為了研究光誘導(dǎo)后短時(shí)mRNA表達(dá)水平的變化，采用RNA-seq的方法分析了受到光照后0h、0.5 h、4 h和8 h的轉(zhuǎn)錄組信息。在0.5hvs0h中有843個(gè)DEGs；G O功能

7、富集分析將它們分為31個(gè)功能組別；KEGG Pathway分析獲得30條顯著性富集的通路。在4 h vs0.5 h中有865個(gè)DEGs；GO功能富集分析將它們分為31個(gè)功能組別；KEGG Pathway分析獲得28條顯著性富集的通路。在8 h vs4 h中有223個(gè)DEGs; G O功能富集分析將它們分為27個(gè)功能組別;KEGG Pathway分析獲得18條顯著性富集的通路。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)注釋為花青素合成結(jié)構(gòu)基因的CHS、CHI、F3H

8、、F3，5，H、DFR、ANS、調(diào)節(jié)基因MYB1以及光信號(hào)正調(diào)控因子HY5的表達(dá)模式均為從0 h到0.5 h基因表達(dá)水平變化不顯著或略微上調(diào)表達(dá)，0.5 h到4 h大幅度上調(diào)表達(dá)，4h到8h基因表達(dá)水平變化不顯著或略微下調(diào)表達(dá)，表現(xiàn)出明顯的光誘導(dǎo)性。
　　6)克隆了茄子CHS、CHI、F3 H基因全長(zhǎng)序列，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期克隆的DFR以及NCBI中的F3，5，H和ANS，分析了這6個(gè)基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。qRT-PCR結(jié)果顯示，

9、它們?cè)诟?、莖、葉、花、果皮和果肉中都有表達(dá)。其中CHS、CHI、F3，5，H、DFR和ANS在果皮中的表達(dá)量最高，而僅有F3H在莖中表達(dá)量最高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)花青素含量與CHS、CHI、F3，5，H、DFR和ANS的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，除了 F3H。套袋茄子的果皮中幾乎沒有檢測(cè)到CHI、F3，5，H、DFR和ANS的表達(dá)量，而正常生長(zhǎng)茄子的果皮中CHS和 F3H的表達(dá)量也分別比套袋茄子果皮中的表達(dá)量高4.50倍和51.94倍。6個(gè)基因在

10、低溫下表達(dá)量都升高，其中CHS上升幅度最大。亞細(xì)胞定位顯示CHS、CHI、F3H和DFR都定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。轉(zhuǎn)CHS、CHI、F3H和DFR的過表達(dá)擬南芥株系的莖和果莢都積累了更多的花青素。
　　7)從茄子中克隆了兩個(gè)藍(lán)光受體基因，CRY1和CRY2，以及光信號(hào)負(fù)/正調(diào)控因子COPIIHY5。結(jié)合已被證明參與了調(diào)控茄子花青素的合成MYB1，發(fā)現(xiàn)CRY1在葉中的表達(dá)量最高，CRY2在根和果皮中的表達(dá)量最高，COP1在花中的表達(dá)

11、量最高，MYB1在果皮中的表達(dá)量最高，而HY5在6種組織中的表達(dá)量沒有顯著差異。光能促進(jìn)CRY】、CRY2、HY5和MYB1的表達(dá)，而抑制COPI的表達(dá)。在藍(lán)光下CRY1和CRY2的轉(zhuǎn)基因植株部分恢復(fù)了下胚軸長(zhǎng)度表型，CRY2的轉(zhuǎn)基因植株也恢復(fù)了開花時(shí)間，COP1的轉(zhuǎn)基因植株抑制了光下的花青素積累和黑暗下的子葉張開表型，而HY5轉(zhuǎn)基因植株的下胚軸恢復(fù)了與野生型相似的長(zhǎng)度。這些結(jié)果表明這四個(gè)基因具有CRY1、CRY2、COP1和HY5的功

12、能。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CRY1和CRY2分別能與COP1在酵母和植物中發(fā)生依賴于藍(lán)光的相互作用。同樣COP1能分別與HY5和MYB1在酵母和植物中發(fā)生相互作用。酵母單雜交實(shí)驗(yàn)顯示，HY5和MYB1可以結(jié)合到CHS和DFR的啟動(dòng)子上。由此，本研究提供了一個(gè)新的描述光誘導(dǎo)茄子花青素合成的調(diào)控通路：在光下，光受體蛋白CRY1和CRY2接受光信號(hào)后與COP1結(jié)合，使下游轉(zhuǎn)錄因子HY5和 MYB1得到了積累，從而與CHS和DFR