syncytin基因真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-tag 2B-syncytin的構(gòu)建.pdf

1、天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文syncytin基因真核表達(dá)質(zhì)粒pCMVtag2Bsyncytin的構(gòu)建姓名：王杰申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：謝炳玓20100501天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文接酶作用下，室溫5分鐘快速連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TranslT1phageResisitant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞，并接種于Ka抗性瓊脂培養(yǎng)皿，挑取陽性重組子。③重組質(zhì)粒的鑒定：取陽性克隆菌液，進(jìn)行直接菌液PCR法鑒定，然后對初步鑒定為陽性克隆的菌液

2、提取質(zhì)粒，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI進(jìn)行質(zhì)粒的雙酶切鑒定，并通過測序進(jìn)一步鑒定。④轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞株(Hela)：轉(zhuǎn)染前一天，以3105個細(xì)胞／孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)于無抗生素的生長培養(yǎng)基中，待細(xì)胞生長至80％細(xì)胞融合時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法按Invitrogen公司提供的Lipofectamine2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染分兩組，分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMVtag2Bsyncytin與空載體pCMVtag2B，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞于37

3、℃，5％C02條件下培養(yǎng)。⑤檢測人宮頸癌細(xì)胞(Hela)syncytinmRNA水平：提取Hela細(xì)胞總RNA，在MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，以13actin作為為內(nèi)參。結(jié)果①成功從人胎盤組織克隆了人syncytin基因編碼區(qū)全長。②成功構(gòu)建syncytin基因真核表達(dá)載體pCMVtag2Bsyncytin，分別采用PCR及酶切鑒定，可得到相應(yīng)大小的目的條帶。⑧插

4、入pCMVtag2B載體的syncytin基因序列分析與Genebanksyncyfin基因序列符合率為99％，不匹配堿基經(jīng)遺傳密碼子表比對，均編碼同一氨基酸。④重組質(zhì)粒pCMVtag2B—syncytin轉(zhuǎn)染至人宮頸癌細(xì)胞(Hela)，實時熒光定量PCR檢測syncytinmRNA水平，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMVtag2B—syncyfin基因組syncytinmRNA水平比轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pCMVtag2B組顯著增高(PO01)，表明重組質(zhì)粒