低雄激素誘導雄性大鼠血管內(nèi)皮細胞凋亡的研究.pdf

1、背景：近年來，雄激素與心血管疾病間的關系日益受到重視，在臨床研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)部分心血管疾病高發(fā)的中老年男子的雄激素處于低水平狀態(tài)。雄激素不足與心血管疾病的發(fā)生密切相關，而且已有報道，低雄激素水平是血管內(nèi)皮功能失調(diào)的一個獨立危險因素。致病因子可以通過多種途徑損傷血管內(nèi)皮，其中內(nèi)皮細胞(EC)的凋亡在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中起了重要作用。許多促動脈粥樣硬化因子都可以誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡，進一步引起一系病理生理反應，產(chǎn)生相應的心血管

2、疾病。雄激素缺乏作為一種心血管危險因素是否也增加內(nèi)皮細胞凋亡值得進一步研究。因此本研究通過建立低雄激素大鼠模型，初步探討雄激素缺乏對血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響。本研究分為五個部分：
　　 第一部分：低雄激素大鼠模型的建立。
　　 目的：采用大鼠雙側睪丸切除術，建立低雄激素大鼠模型，并檢測模型是否成功。
　　 方法：18 只雄性SD 大鼠隨機分為三組(n=6)，對照組，給予假去勢；去勢組，施行去勢手術，建成低雄激素模型

3、；替代組，施行去勢手術后，給予肌肉注射睪酮（十一酸睪酮50mg/Kg/月）替代治療；實驗結束時采血測睪酮水平。
　　 結果：而實驗結束時去勢組大鼠血清睪酮水平顯著低于其他兩組（P<0.05）。
　　 結論：采用大鼠雙側睪丸切除術，可以建立低雄激素模型，且具有較好的穩(wěn)定性。
　　 第二部分：去勢大鼠血管內(nèi)皮及其線粒體病理改變。
　　 目的：觀察大鼠主動脈大體結構及其內(nèi)皮細胞超微結構。
　　 方法：建

4、模成功10 周末，固定麻醉大鼠，分離腹主動脈，取一段4％多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，部分蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察各組大鼠主動脈結構的病理改變；另取一段2.5％戊二醛固定，透射電鏡觀察血管內(nèi)皮超微結構改變。
　　 結果：HE 染色結果示，三組大鼠中，對照組主動脈肌層平滑肌細胞排列整齊規(guī)則，內(nèi)膜光滑完整，薄厚均一，內(nèi)皮細胞扁平，去勢組主動脈內(nèi)皮形態(tài)結構排列紊亂，內(nèi)膜下細胞增生明顯；替代組動脈內(nèi)膜病變明顯較去勢組減輕。

5、透射電鏡觀察，對照組主動脈內(nèi)皮細胞扁平，結構清晰，內(nèi)膜光滑完整，高倍鏡下線粒體形態(tài)、大小均勻，嵴清晰。去勢組主動脈內(nèi)皮細胞結構不清晰，變性，突起或脫落，染色質(zhì)凝集，線粒體皺縮，數(shù)量減少，嵴溶解。給予雄激素替代治療后其主動脈內(nèi)皮病變較去勢組明顯減輕。
　　 結論：去勢后大鼠主動脈結構破壞明顯，內(nèi)皮細胞染色質(zhì)凝集，線粒體皺縮，數(shù)量減少，嵴斷裂，溶解。
　　 第三部分：內(nèi)皮細胞線粒體膜電位的變化及凋亡情況分析。
　　

6、目的：觀察三組大鼠主動脈內(nèi)皮細胞線粒體膜電位的變化情況，同時檢測內(nèi)皮細胞凋亡情況。
　　 方法：采用密度差速離心方法提取內(nèi)皮細胞線粒體，向提取的線粒體中加入儲存液制備成純化線粒體提取物，將陽離子熒光羰花青染料加入純化線粒體制備物中暗室孵育10min，后用熒光酶標儀檢測，通過熒光信號的強度來分析線粒體內(nèi)膜功能的完整性；同時取一段主動脈標本，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，采用TUNEL 法檢測血管內(nèi)皮細胞凋亡情況。
　　

7、 結果：與對照組和替代組相比，去勢組大鼠純化線粒體熒光信號強度明顯減弱，內(nèi)膜功能受損TUNEL 檢測結果示與其他兩組相比，去勢后大鼠主動脈內(nèi)皮細胞凋亡數(shù)量明顯增多（P<0.05）。
　　 結論：去勢組大鼠血管內(nèi)皮線粒體膜電位降低，內(nèi)膜功能受到損害，細胞凋亡增多。
　　 第四部分：線粒體凋亡途徑相關因子在血管內(nèi)皮表達情況。
　　 目的：觀察三組大鼠主動脈內(nèi)皮細胞線粒體凋亡途徑中相關因子的表達情況。
　　 方

8、法：采用real time RT-PCR 技術測定內(nèi)皮細胞bcl-2、caspase-9 和caspase-3 mRNA 表達水平；免疫組化方法檢測內(nèi)皮細胞細胞色素C(Cytochrome c Cyt C), caspase-9 和caspase-3 蛋白表達情況。
　　 結果：與對照組相比，去勢組內(nèi)皮細胞bcl-2 表達減少，而Cyt C，caspase-9和caspase-3 表達顯著增高(P<0.05)，替代組與對照組間均

9、無顯著性差異(P>0.05)。
　　 結論：雄性大鼠體內(nèi)雄激素缺乏時，血管內(nèi)皮細胞線粒體凋亡抑制因子表達下調(diào)，而凋亡相關因子表達上調(diào)。
　　 第五部分：內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)及胞內(nèi)游離鈣離子濃度測定。
　　 目的：體外培養(yǎng)去勢后大鼠主動脈內(nèi)皮細胞，觀察細胞內(nèi)第二信使游離鈣離子濃度改變。
　　 方法：建模成功的大鼠，麻醉固定后，打開腹腔，游離主動脈，采用膠原酶消化法分離純化并培養(yǎng)主動脈內(nèi)皮細胞，Ⅷ 因子相關抗原鑒