胚胎干細(xì)胞中肝干細(xì)胞的篩選及在治療性肝再生中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分體外誘導(dǎo)E14小鼠ESC分化為肝細(xì)胞的研究.目的:基于肝臟發(fā)育生物學(xué)進(jìn)展,建立有效誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(ESC)向肝細(xì)胞分化的體外培養(yǎng)體系.方法:小鼠ESC細(xì)胞系E14,在內(nèi)含1000U/ml的rmLIF的無(wú)飼養(yǎng)層高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),去除rmLIF后用懸滴培養(yǎng)法制備成擬胚體.依次加入10<'-7>M的Dexamethasone、10ug/L的FGF-4、25ug/L的HGF等誘導(dǎo)因子,繼續(xù)培養(yǎng)1-2周.然后取分化細(xì)胞,行細(xì)胞形態(tài)

2、學(xué)觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)白蛋白和CK8/18的表達(dá)、RT-PCR檢測(cè)白蛋白和轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白等肝細(xì)胞特征性蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄水平.糖原染色、尿素合成功能檢測(cè)則對(duì)其功能進(jìn)行檢驗(yàn).結(jié)論:1.加入FGF-4、HGF和Dex等肝臟胚胎發(fā)育時(shí)期的關(guān)鍵性調(diào)控因子的體外培養(yǎng)體系可以誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞.2.發(fā)育生物學(xué)在ESC定向誘導(dǎo)分化研究中有一定的指導(dǎo)意義.第二部分淤膽血清"病理微環(huán)境"下ESC中肝干細(xì)胞的篩選.目的:探討淤膽血清"病理

3、微環(huán)境"培養(yǎng)體系誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(ESC)向肝細(xì)胞分化的效果及對(duì)肝干細(xì)胞的篩選作用.方法:將小鼠ESC細(xì)胞系E14在無(wú)白血病抑制因子培養(yǎng)基中培養(yǎng),使其自發(fā)分化為擬胚體,加入FGF-4和HGF初步誘導(dǎo),然后置于5％淤膽鼠血清"病理微環(huán)境"篩選培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2周,然后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,白蛋白和CK8/18免疫熒光染色,電鏡檢查和吲哚氰綠(ICG)攝取試驗(yàn).結(jié)論:采用含淤膽血清的"病理微環(huán)境"培養(yǎng)體系從經(jīng)FGF-4和HGF初步誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)

4、胞中有效篩選出了具有功能的肝細(xì)胞樣細(xì)胞,細(xì)胞有較好的均質(zhì)性,為臨床肝細(xì)胞替代治療的獲取豐富供體細(xì)胞來(lái)源提供了新思路.第三部分ESC源性肝干細(xì)胞在治療性肝再生中的應(yīng)用.目的:應(yīng)用治療性肝再生模型進(jìn)行ESC源性肝干細(xì)胞肝內(nèi)移植,觀察其在肝組織替代、體內(nèi)的生長(zhǎng)分化及成瘤性等情況,為ESC移植在難治性肝病治療中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).方法:倒千里光堿+70%肝部分切除建立BALB/c小鼠的治療性肝再生模型.用熒光示蹤劑CFDA SE標(biāo)記移植細(xì)胞

5、,將經(jīng)淤膽血清"病理微環(huán)境"篩選體系篩選出的ESC源性肝干細(xì)胞經(jīng)門靜脈移植入治療性肝再生模型小鼠肝內(nèi).然后熒光顯微鏡下觀察,檢測(cè)移植細(xì)胞體內(nèi)分布、整合與肝細(xì)胞替代、體內(nèi)生長(zhǎng)分化等情況.2周后行白蛋白熒光免疫組化(雙熒光染色)、血清白蛋白水平檢測(cè)其功能狀況.并通過(guò)觀察其體內(nèi)成瘤性對(duì)篩選出的ESC源性肝干細(xì)胞的安全性進(jìn)行評(píng)估.結(jié)論:經(jīng)淤膽血清"病理微環(huán)境"篩選體系篩選出的ESC源性肝干細(xì)胞移植入治療性肝再生模型鼠肝內(nèi)后可有效整合入宿主肝板、