蜂膠水提物對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞膽固醇酯聚集及凋亡的影響.pdf

1、目的： 研究蜂膠水提物(water extract propolis,WEP)對(duì)氧化型低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein,ox-LDL) 誘導(dǎo)的人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(buman umbilical arterysmooth muscle cell，HUASMC)膽固醇酯(cholesteryl ester,CE)聚集及凋亡的影響，探討WEP 抗動(dòng)脈粥樣硬化作用可能的機(jī)制，為蜂膠的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)

2、應(yīng)用提供依據(jù)。 方法： 1.制備 WEP：采用超聲波法萃取泰山蜂膠，其水溶性成分用于實(shí)驗(yàn)研究。 2.培養(yǎng) HUASMC 及鑒定：取新鮮臍帶臍動(dòng)脈的中膜平滑肌層，采用貼塊法培養(yǎng)HUASMC；經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。 3.制備 ox-LDL，測(cè)定其氧化修飾程度：以 Cu<'2+>誘導(dǎo)法催化低密度脂蛋白氧化，采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物法測(cè)定其中MDA含量，以確定其氧化修飾程度。 4.制備平滑肌

3、源性泡沫細(xì)胞模型：分別以 25mg/L、50mg/L、75mg/L 三個(gè)濃度ox-LDL 與平滑肌細(xì)胞共同培養(yǎng)，于 12h、24h、36h、48h、60h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(total cholesterol,TC)和游離膽固醇(free cholesterol,FC)含量，以TC 減 FC得出CE的含量，CE/TC 比值>50％作為泡沫細(xì)胞的標(biāo)志，選擇 50mg/L OX-LDL 作用48h 作為制備平滑肌源性泡沫細(xì)胞模型的

4、適宜條件。 5.實(shí)驗(yàn)分組：培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為五組對(duì)照組：正常培養(yǎng)基模型組：50 mg/L ox-LDL 作用48hWEP 干預(yù)組：分別以50mg/L、100mg/L、200mg/L 三個(gè)濃度的WEP與50mg/Lox-LDL 共同作用 48h： 6.通過(guò)油紅O染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)成分進(jìn)行染色，觀察各組細(xì)胞荷脂情況； 7.采用高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TC和FC的含量，從中得出CE的含量，根據(jù)細(xì)胞蛋白定量。 8.采用流

5、式細(xì)胞儀技術(shù) Annexin V/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果： 1.平滑肌源性泡沫細(xì)胞模型的制備： 采用 50mg/Lox-LDL 與平滑肌細(xì)胞共同培養(yǎng)45h，可使細(xì)胞內(nèi) CE/TC比值>50％，而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。 2.WEP 對(duì)細(xì)胞內(nèi)CE聚集影響的形態(tài)學(xué)觀察： 經(jīng)油紅O染色后顯示，模型組與對(duì)照組相比細(xì)胞內(nèi)脂滴含量明顯增多，50 mg/L、100mg/L、200mg/L 三個(gè)濃度WEP干預(yù)

6、組細(xì)胞內(nèi)脂滴比模型組少，且隨WEP濃度的增高，脂滴的數(shù)量有減少的趨勢(shì)。 3.WEP對(duì)細(xì)胞內(nèi)CE含量的影響： 模型組細(xì)胞內(nèi)CE含量高于對(duì)照組(P<0.01)，50 mg/L、100mg/L、200mg/L 三個(gè)濃度WEP干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)CE的含量都低于模型組(P<0.01)，且隨WEP濃度的增高細(xì)胞內(nèi)CE含量有減少的趨勢(shì)； 4.WEP 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響： 模型組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(P<0.01)，50 mg/

7、L、100mg/L、200mg/L 三個(gè)濃度WEP 干預(yù)組細(xì)胞凋亡率都低于模型組(P<0.01)，且隨WEP濃度的增高細(xì)胞凋亡率有降低的趨勢(shì)。 5.細(xì)胞內(nèi)CE含量與細(xì)胞凋亡率之間相關(guān)性分析： 細(xì)胞內(nèi)CE含量與細(xì)胞凋亡率之間存在正相相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.964，P<0.01。 結(jié)論： 1.ox-LDL<'1> 引起體外培養(yǎng)的HUASMC 細(xì)胞內(nèi)CE聚集，而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，同時(shí)也能導(dǎo)致HUASMC凋亡率增加