游離膽固醇過載誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞損傷的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化疾病是現(xiàn)代社會(huì)中最為常見的心血管疾病之一，其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，是一種多致病因素的高發(fā)病率疾病。在動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程中，泡沫化細(xì)胞的出現(xiàn)和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的病理特征。在病變后期，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊區(qū)域內(nèi)過量的平滑肌細(xì)胞損傷及死亡直接影響了斑塊區(qū)域結(jié)構(gòu)的完整性，降低斑塊穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致斑塊破裂并形成血栓，造成血管堵塞，因此平滑肌細(xì)胞的死亡在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中起了重要作用。
　　 在體內(nèi)，泡沫化

2、細(xì)胞的來源主要是巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。在以往的實(shí)驗(yàn)中，泡沫化細(xì)胞的研究主要集中于巨噬細(xì)胞的泡沫化模型，對(duì)于平滑肌細(xì)胞來源的泡沫化細(xì)胞模型研究較少。最近的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)過量的游離膽固醇可能是造成巨噬細(xì)胞源泡沫化細(xì)胞死亡的原因之一。游離膽固醇可能通過激活線粒體凋亡通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路導(dǎo)致巨噬細(xì)胞源泡沫化細(xì)胞的凋亡。但細(xì)胞內(nèi)過量游離膽固醇和平滑肌細(xì)胞死亡之間的聯(lián)系還未見報(bào)道。
　　 本論文采用大鼠胸/腹主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和水溶性膽固醇

3、(CHOL:MβCD)共孵育的方法建立起平滑肌來源的泡沫化細(xì)胞模型，并結(jié)合細(xì)胞內(nèi)酰基輔酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)的特異性阻斷劑Sandoz58035，建立起游離膽固醇過載的平滑肌細(xì)胞模型。通過對(duì)病變平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子、線粒體鈣、活性氧(ROS)濃度、線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)、線粒體膜電位等觀察分析以及線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路上相關(guān)蛋白的表達(dá)情況的測定對(duì)游離膽固醇造成的平滑肌細(xì)胞早期損傷和細(xì)胞凋亡壞死機(jī)制作出了初步的研究。本論文還通過觀察自

4、噬小體的形成以及自噬特異性標(biāo)志蛋白LC3含量變化的測定檢測了平滑肌細(xì)胞在游離膽固醇刺激下自噬的激活情況。結(jié)合藥物干擾自噬在平滑肌細(xì)胞內(nèi)的激活，從細(xì)胞和分子水平研究了游離膽固醇激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)自噬產(chǎn)生的發(fā)生機(jī)制。本論文對(duì)游離膽固醇過載情況下平滑肌細(xì)胞內(nèi)一系列生理病理的變化進(jìn)行了模擬，對(duì)相關(guān)細(xì)胞機(jī)制進(jìn)行了分析，為深入理解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理和發(fā)病過程提供了理論基礎(chǔ)。
　　 本論文得到的主要研究成果有：
　　 1.利用平滑肌

5、細(xì)胞和水溶性膽固醇共孵育建立起平滑肌細(xì)胞源的泡沫化細(xì)胞模型。同時(shí)利用ACAT酶特異性阻斷劑Sandoz58035作用于平滑肌源的泡沫化模型建立游離膽固醇過載的細(xì)胞模型，模擬了動(dòng)脈粥樣硬化中后期平滑肌細(xì)胞的病變過程。
　　 2.利用泡沫化模型和游離膽固醇過載模型，比較兩類細(xì)胞模型內(nèi)鈣離子，線粒體鈣離子以及細(xì)胞內(nèi)ROS含量水平的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在游離膽固醇載入過程中細(xì)胞內(nèi)鈣離子和線粒體鈣離子濃度出現(xiàn)明顯下降，而ROS含量隨孵育時(shí)間的增

6、加而上升，在正常細(xì)胞和泡沫化平滑肌細(xì)胞中這三種物質(zhì)濃度基本維持在穩(wěn)定的水平，驗(yàn)證了細(xì)胞內(nèi)多余的游離膽固醇影響了平滑肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài).
　　 3.對(duì)平滑肌細(xì)胞的線粒體進(jìn)行熒光標(biāo)記和線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)的實(shí)時(shí)觀察、記錄、分析。發(fā)現(xiàn)在游離膽固醇過載的平滑肌細(xì)胞中，線粒體在游離膽固醇載入后4-8小時(shí)內(nèi)發(fā)生斷裂，由正常狀態(tài)下的網(wǎng)狀轉(zhuǎn)變?yōu)樗辄c(diǎn)狀。
　　 4.從線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路對(duì)游離膽固醇造成的平

7、滑肌細(xì)胞凋亡壞死進(jìn)行進(jìn)一步的分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)游離膽固醇的載入可以導(dǎo)致線粒體膜電位的崩解，改變細(xì)胞內(nèi)bcl-2、bax蛋白含量并導(dǎo)致線粒體內(nèi)cytoc的釋放，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力蛋白KDEL表達(dá)量在游離膽固醇的刺激下大大上升并激活UPR反應(yīng)過程中CHOP蛋白的表達(dá).說明游離膽固醇通過線粒體凋亡通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路的激活造成細(xì)胞死亡。
　　 5.對(duì)游離膽固醇過載的平滑肌細(xì)胞內(nèi)自噬的水平進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)游離膽固醇的載入可以導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生

8、自噬。同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬的程度和游離膽固醇載入的濃度和時(shí)間均有關(guān)系。利用自噬的阻斷劑3-MA和增強(qiáng)劑rapamycin說明自噬的產(chǎn)生減輕了游離膽固醇造成的平滑肌細(xì)胞損傷。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)自噬通過清除損傷的細(xì)胞器如線粒體來實(shí)現(xiàn)對(duì)游離膽固醇造成的平滑肌損傷的保護(hù)作用，但同時(shí)過量的自噬也有可能直接導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)自噬樣壞死。
　　 細(xì)胞內(nèi)過量的游離膽固醇對(duì)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的功能結(jié)構(gòu)造成損傷。輕度損傷的細(xì)胞器可以通過激活自噬的發(fā)生得

9、以清除，從而減輕細(xì)胞器損傷帶來的細(xì)胞壓力。過量的細(xì)胞器損傷則可以激活細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路，造成平滑肌細(xì)胞的死亡。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)過量的自噬也可能直接造成平滑肌出現(xiàn)自噬樣死亡。因此，游離膽固醇造成的平滑肌細(xì)胞損傷是一個(gè)由細(xì)胞凋亡，自噬和細(xì)胞壞死等多種機(jī)制調(diào)控的復(fù)雜細(xì)胞死亡事件。
　　 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)主要有以下幾點(diǎn)：
　　 1.利用水溶性膽固醇和ACAT酶的抑制劑和平滑肌細(xì)胞共孵育來建立泡沫化和游離膽固醇過載的平滑肌細(xì)胞模型在國內(nèi)研

10、究中還較少見，很好的解決了平滑肌來源的泡沫化細(xì)胞模型穩(wěn)定性、重復(fù)性差的問題。兩類細(xì)胞模型分別模擬了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中平滑肌細(xì)胞可能出現(xiàn)的病理變化，實(shí)現(xiàn)了體外建立起平滑肌細(xì)胞泡沫化病變的病理模型。
　　 2.本研究從線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)變化著手，結(jié)合線粒體凋亡通路上多個(gè)作用靶點(diǎn)的深入研究，提出線粒體是游離膽固醇造成的平滑肌損傷的重要作用靶點(diǎn)。同時(shí)通過對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)功能的研究也驗(yàn)證了游離膽固醇可以直接作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上并和線粒體通路

11、一樣對(duì)平滑肌細(xì)胞的功能狀態(tài)有著直接的影響，并且這兩條信號(hào)通路相互之間是協(xié)同作用的。通過多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的研究比較完整的解釋游離膽固醇造成平滑肌細(xì)胞損傷的細(xì)胞機(jī)制。
　　 3.本研究利用多種技術(shù)手段驗(yàn)證了自噬在游離膽固醇過載的平滑肌細(xì)胞中的激活。結(jié)合自噬特異性的抑制劑和激動(dòng)劑等方法，對(duì)自噬在游離膽固醇造成的平滑肌損傷過程中可能的細(xì)胞機(jī)制做出了解釋，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了自噬在游離膽固醇造成的平滑肌細(xì)胞損傷過程中起到了一定的保護(hù)作用，并且