丹參素對(duì)氧化低密度脂蛋白致血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響和機(jī)制.pdf

1、目的： 通過(guò)研究丹參素對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致血管平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探討丹參素在動(dòng)脈粥樣硬化中所起的保護(hù)作用及可能機(jī)制，使中藥的運(yùn)用更具有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為弘揚(yáng)祖國(guó)醫(yī)藥學(xué)作出貢獻(xiàn)。 方法： 1.大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的原代培養(yǎng)和鑒定：取Wister大鼠胸主動(dòng)脈，用反復(fù)貼塊法培養(yǎng)大鼠VSMCs，用光鏡和免疫組化鑒定。培養(yǎng)5-10代用于實(shí)驗(yàn)。 2.氧化低密度脂蛋白的制備：

2、將購(gòu)買(mǎi)的低密度脂蛋白(LDL)，取少量行Lowry法蛋白含量測(cè)定。采用銅離子氧化。用丙二醛(MDA)測(cè)定法測(cè)定處理前后的LDL中MDA含量以確定LDL是否氧化成ox-LDL。 3.丹參素(DSS)的制備：取10 mg丹參素鈉溶于5mlPBS中，0.22/μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?4.不同濃度ox-LDL對(duì)VSMCs生長(zhǎng)的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，分10組，每組六個(gè)孔。

3、用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)兩天后換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)次日各組換用含5％FBS DMEM并分別處理如下：第1組不加ox-LDL；其余各組加ox-LDL，終濃度分別為20、30、40、50、60、70、80、90、100mg/1，24小時(shí)后通過(guò)MTT法檢測(cè)OD值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，并以每組各孔平均OD值繪制增殖曲線(xiàn)。 5.不同濃度DSS對(duì)ox-LDL促VSMCs增殖的影響：收集細(xì)胞以每孔2 ×103個(gè)細(xì)胞接種于96

4、孔板中，分4組，每組六個(gè)孔。培養(yǎng)三天后(方法同前)各組分別處理如下：①5％FBS DMEM；②5％FBS DMEM+50mg/l ox-LDL；③5％FBSDMEM+50mg/lox—LDL+50 mg/L DSS；④5％FBS DMEM+50mg/l ox—LDL+100mg/L DSS，24小時(shí)后通過(guò)MTT法檢測(cè)OD值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。收集細(xì)胞以每孔6×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中的四個(gè)孔中，培養(yǎng)三天后各孔分別處理如下：①5％FBS

5、 DMEM；②5％FBS DMEM+50mg/l ox—LOL；③5％FBS DMEM+50mg/lox-LDL+50 mg/L DSS；④5％FBS DMEM+50mg/l ox-LDL+100 mg/L DSS，20小時(shí)后分別提取四孔中細(xì)胞m RNA，RT反轉(zhuǎn)錄后c DNA經(jīng)特異性引物再PCR，以GAPDH作內(nèi)標(biāo)，測(cè)定每組PDGF-BB m RNA的表達(dá)水平。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。 6.不同濃度DSS對(duì)ox-LDL促凋亡的影響：

6、收集細(xì)胞以每孔6x104 個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中的4個(gè)孔中，培養(yǎng)三天(方法同前)后分別干預(yù)如下：①5％FBS DMEM；②5％FBS DMEM+100mg/l ox-LDL；③5％FBS DMEM+100mg/l ox-LDL+50mg/L DSS；④5％FBS DMEM+1OOmg/l ox-LDL+100 mg/L DSS,16小時(shí)后觀(guān)察各孔細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)并拍攝，收集各孔細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。 7.統(tǒng)計(jì)

7、分析：使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件11.5版本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(（x-）±s)表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用方差分析(F檢驗(yàn))，P＜0.05：有顯著性差異。 結(jié)果： 1.原代大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)和免疫組化鑒定：采用自行探索的反復(fù)貼塊法培養(yǎng)細(xì)胞，血管片成功貼附，反復(fù)利用，短期內(nèi)就獲得了大量的細(xì)胞。貼附良好的血管片周?chē)?天即可見(jiàn)數(shù)個(gè)形態(tài)較規(guī)則的梭形細(xì)胞，有些血管片周?chē)?xì)胞呈輻射狀生長(zhǎng)，細(xì)胞大部分呈梭形。原代培養(yǎng)4-10天可見(jiàn)細(xì)胞不斷分裂增

8、多，有些局部細(xì)胞生長(zhǎng)相當(dāng)密集以致看不清形態(tài)。部分區(qū)域細(xì)胞生長(zhǎng)呈特征性的“峰”和“谷”生長(zhǎng)形態(tài)。免疫組化鑒定：熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞體呈長(zhǎng)梭形，所有細(xì)胞胞漿染色棕黃色是為陽(yáng)性，胞核不著色。 2.原代大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)特征：原代培養(yǎng)細(xì)胞局部生長(zhǎng)相當(dāng)密集時(shí)，即可視情況1:1或1:2傳代，傳代后數(shù)小時(shí)細(xì)胞即貼壁，次日可見(jiàn)細(xì)胞全部貼壁，第3-4天培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞即可按1:3或1:4傳代。 3.氧化低密度脂蛋白的制備：LDL行Lo

9、wry法含量測(cè)定濃度為6.0mg/ml，體積為330μl。氧化前后的LDL行丙二醛測(cè)定含量分別為1.5μmol/L和17.2μmol/L證實(shí)LDL已被氧化成ox-LDL[1]。 4.不同濃度ox-LDL對(duì)VSMCs生長(zhǎng)的影響：MTT 實(shí)驗(yàn)表明低濃度ox-LDL干預(yù)下，干預(yù)濃度增加，增殖程度(以O(shè)D值表示)增加，在50mg/l組其OD值最大，60 mg/l組OD值開(kāi)始下降，100 mg/l組其OD值最小并在鏡下可見(jiàn)細(xì)胞凋亡。以50

10、 mg/l為增殖實(shí)驗(yàn)干預(yù)濃度，以100 mg/l為凋亡實(shí)驗(yàn)干預(yù)濃度。 5.不同濃度DSS對(duì)ox-LDL促VSMC增殖的影響：MTT實(shí)驗(yàn)表明各組OD值有顯著差異性，DSS呈劑量依賴(lài)性降低ox-LDL引起的OD值升高。RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明各組PDGF-BB的表達(dá)水平有顯著差異：DSS呈劑量依賴(lài)性降低ox-LDL引起的PDGF-BB的表達(dá)水平升高。 6.不同濃度DSS對(duì)ox-LDL促凋亡的影響：各干預(yù)組形態(tài)學(xué)觀(guān)察：①組可見(jiàn)典型

11、的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)特征，細(xì)胞多為梭形呈單層束狀排列；②組可見(jiàn)細(xì)胞胞膜模糊，變圓，細(xì)胞氣泡增多；③組可見(jiàn)細(xì)胞變小變圓并有脫落。④組可見(jiàn)細(xì)胞脫落，壞死，呈現(xiàn)片狀細(xì)胞脫失區(qū)。各組細(xì)胞凋亡指數(shù)有顯著性差異：對(duì)照組無(wú)細(xì)胞凋亡，DSS呈劑量依賴(lài)性增加ox-LDL引起的凋亡指數(shù)的升高。 結(jié)論： ①利用自行探索的反復(fù)貼塊法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞可方便省力，節(jié)約成本，短時(shí)間獲得大量細(xì)胞。 ②丹參素具有對(duì)抗低濃度氧化低密度脂蛋白致平