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文檔簡介
1、目的:用卡莫司汀(BCNU)誘導大鼠皮質(zhì)發(fā)育障礙(DCDs)動物模型,探索BCNU構(gòu)建DCDs動物模型的最佳劑量和方法,為研究DCDs及其致癇機制提供新的動物模型。 方法:1.BCNU誘導大鼠皮質(zhì)發(fā)育障礙模型的建立及評估:采用 BCNU不同劑量(以BCNU 5~20mg/kg梯度劑量)給妊娠17天的SD大鼠作腹腔注射,制作子代SD大鼠DCDs模型。按藥物不同注射劑量分為模型①組(BCNU 5mg/kg)、模型②組(BCNU 10
2、mg/kg)、模型③組(BCNU15mg/kg)和模型④組(BCNU 20mg/kg),同時設(shè)立對照組。對各模型組仔鼠進行以下觀察:①統(tǒng)計各組仔鼠的存活率;觀察各組仔鼠出生時一般狀態(tài)及出生后日常行為,包括意識狀態(tài)、生活能力、有無癲癇發(fā)作等。②分別于出生后當天(P0)、出生后7天(P7)、P21、P56和。P84時間點測量各組仔鼠體重(反映仔鼠生長發(fā)育情況)。③采用Morris水迷宮實驗測試各組仔鼠學習和空間記憶能力。④利用紅藻氨酸誘導各
3、組仔鼠癲癇發(fā)作,比較其癇性發(fā)作閾值和死亡率。⑤于P21、P84兩時間點取各組仔鼠大腦組織觀察其大體形態(tài)、測腦濕重;作常規(guī)病理檢查,觀察各組仔鼠大腦皮質(zhì)和海馬結(jié)構(gòu),以確定是否存在DCDs以及 DCDs的病理類型。通過以上各項指標判定BCNU建立的DCDs模型是否成功及成功建模的最佳藥物劑量和方法學的可靠性。2.相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)檢測:用免疫組織化學方法檢測神經(jīng)肽Y(NPY)和鈣視網(wǎng)膜蛋白(Calretinin)陽性神經(jīng)元在最佳劑量模型組仔鼠大腦
4、中的分布,以初步探索該模型的致癇機制。 結(jié)果:1.各模型組及對照組仔鼠的存活率:對照組與模型①,②,③和④各組仔鼠的存活率分別為100%,100%,93.1%,83.3%和0%,模型④組仔鼠出生當日全部死亡。2.仔鼠一般行為學觀察:模型①組仔鼠各觀察指標與對照組無差別;模型②組仔鼠出生后日常行為與對照組無明顯差異;模型③組仔鼠出生時一般狀態(tài)較正常對照組差,出現(xiàn)活動量減少、反應遲鈍、智能障礙等表現(xiàn)。各模型組沒有觀察到明顯的自發(fā)性癲
5、癇發(fā)作。3.仔鼠生長發(fā)育情況:模型①組仔鼠生長發(fā)育情況與對照組無差別(P>0.05);模型②組出生時體重輕度降低(P<0.05),但隨著鼠齡的增長兩組間差異消失;與對照組相比模型③組仔鼠各時間點平均體重明顯降低,隨鼠齡的增長兩組間差別越顯著(P<0.05)。4.水迷宮實驗:模型①組仔鼠水中逃避潛伏期及跨過原平臺次數(shù)和對照組無統(tǒng)計學意義(P>0.05);模型②組仔鼠第1、2天水中逃避潛伏期比對照組仔鼠延長(P<0.05),第3、4天無統(tǒng)計
6、學差別,跨過原平臺次數(shù)與對照組無差異(P>0.05);訓練期間模型③組仔鼠水中逃避潛伏期始終較對照組延長,第5天撤除平臺后,跨過原平臺所在位置的次數(shù)明顯少于對照組(P<0.05)。5.紅藻氨酸誘發(fā)癲癇發(fā)作實驗:模型①組仔鼠癲癇發(fā)作的潛伏期和持續(xù)時間及死亡率與對照組無差別(P>0.05);模型②組仔鼠癲癇發(fā)作的潛伏期縮短(P<0.05),但癲癇發(fā)作持續(xù)時間及死亡率與對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05);模型③組仔鼠癇性發(fā)作的潛伏期縮短,癲癇
7、持續(xù)狀態(tài)時間較對照組延長,且死亡率明顯高于對照組(P<0.05)。6.大腦組織形態(tài)、腦濕重及病理學檢查比較:模型①組仔鼠大腦組織形態(tài)和腦濕重與對照組相比無差異,無DCDs病理改變;模型②組仔鼠大腦外形及腦濕重與對照組無明顯差別(P>0.05),DCDs 發(fā)生率為41.67%;模型③組仔鼠與對照組相比腦組織重量減輕、形態(tài)異常,隨著鼠齡的增長差別越明顯,DCDs發(fā)生率為100%。典型病理改變包括大腦皮質(zhì)厚度變薄、層狀結(jié)構(gòu)紊亂、神經(jīng)細胞缺失發(fā)
8、育不良,皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元異位等,類似人類皮質(zhì)發(fā)育不良和神經(jīng)元結(jié)節(jié)狀異位。7.神經(jīng)遞質(zhì)檢測:免疫組織化學結(jié)果顯示模型③組仔鼠大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)肽Y神經(jīng)元明顯減少(P<0.05);鈣視網(wǎng)膜蛋白神經(jīng)元在模型③組仔鼠大腦皮質(zhì)和海馬異常表達,且神經(jīng)元發(fā)育不良。 結(jié)論:1.本實驗給予孕17d SD大鼠腹腔注射BCNU 15mg/kg可以制作出理想的仔鼠DCDs模型,而腹腔注射BCNU5mg/kg、10mg/kg不能成功建立DCDs模型,20
9、mg/kg的劑量過大。2.本模型仔鼠生長發(fā)育差、行為學異常、學習記憶障礙、癲癇發(fā)作閾值低,又具有典型的DCDs病理改變,很好地體現(xiàn)了人類DCDs的行為學和病理學特征。3.本模型仔鼠大腦中神經(jīng)肽 Y 和鈣視網(wǎng)膜蛋白神經(jīng)元的異常為DCDs易致癇性發(fā)作的機制提供了理論依據(jù)。4.本模型仔鼠DCDs能模擬人類大腦皮質(zhì)發(fā)育不良及神經(jīng)元異位,與國外孕15d腹腔注射BCNU 20mg/kg模型相比仔鼠存活率更高,模型的重復性更好,且操作簡單,是一種新的
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