慢病毒載體介導(dǎo)NK4基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞靶向治療胃癌的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 1、建立人骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone-derived mesenchymal stemcells,hBMSCs)體外分離、培養(yǎng)、傳代的方法;
　　 2、構(gòu)建NK4和增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescentprotein,EGFP)融合基因的重組慢病毒表達載體;
　　 3、探討hBMSCs在體內(nèi)外對胃癌的趨向性;
　　 4、觀察慢病毒介導(dǎo)NK4基因修

2、飾的hBMSCs對胃癌的治療效果及其相關(guān)抗腫瘤機制,期望為胃癌的基因治療探索一條新途徑。
　　 方法:
　　 1、hBMSCs分離培養(yǎng)及鑒定:采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng),流式細胞儀檢測CD34、CD44、CD45、CD105及骨誘導(dǎo)進行鑒定,成骨采用茜素紅染色鑒定;
　　 2、采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)從肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Fact

3、or,HGF)cDNA中克隆NK4基因,并經(jīng)測序鑒定;以攜帶EGFP的pGC-FU慢病毒載體系統(tǒng)作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介,采用In-Fusion技術(shù)構(gòu)建NK4-EGFP融合基因的重組慢病毒表達載體,通過觀察熒光及Westernblot檢測GFP蛋白表達:實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RTQ-PCR)檢測慢病毒滴度;
　　 3、將攜帶NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)及僅攜

4、帶EGFP的慢病毒(Lenti-GFP)轉(zhuǎn)染hBMSCs,通過觀察熒光及流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染率確定最佳感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI);采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)及Western blot檢測Lenti-NK4轉(zhuǎn)染hBMSCs后NK4表達:
　　 4、建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型:采用胃癌細胞:懸液皮下注射及瘤組織塊接種兩

5、種方法:建立胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移模型:采用胃癌細胞懸液及瘤組織塊細胞懸液腹腔注射兩種方法:
　　 5、hBMSCs對胃癌趨向性研究:(1)體外細胞遷移實驗采用Transwell共培養(yǎng)體系,下室培養(yǎng)胃癌細胞株MKN45、胃上皮細胞株GES-1、同時設(shè)置空白對照組(培養(yǎng)基),24小時后上室分別加入hBMSCs、hFB,24小時后取出小室,結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計數(shù)。(2)胃癌皮下移植瘤裸鼠成瘤后隨機分為三組(每組5只),分別尾靜脈注射hB

6、MSCs-GFP、hFB-GFP、Lenti-GFP,7天后處死裸鼠,取瘤體、心、肝臟、脾臟、肺、腎臟,冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察瘤體及各臟器GFP表達情況。
　　 6、以hBMSCs為載體的NK4基因治療對胃癌治療效果:32只裸鼠成瘤后隨機分為四組:hBMSCs-NK4治療組、Lenti-NK4治療組、hBMSCs-GFP對照組和PBS對照組,分別在分組后0、7、14、21天尾靜脈注射給藥;測量瘤體大小,按πabc/6計算體積

7、;HE染色觀察組織病理學(xué)變化,免疫組織化學(xué)方法(Immunohistochemistry,IHC)檢測CD31、增殖細胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen,PCNA)表達,原位缺口末端標記法(terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)檢測細胞凋亡。
　　 結(jié)果:
　　 1、分

8、離培養(yǎng)的hBMSCs流式細胞術(shù)檢測顯示CD44、CD105陽性,而CD34、CD45陰性,符合MSCs特征;hBMSCs經(jīng)骨誘導(dǎo)后茜素紅染色陽性。
　　 2、構(gòu)建的NK4-EGFP融合基因的重組慢病毒表達載體轉(zhuǎn)入293T細胞后可正常表達;重組慢病毒(Lenti-NK4)滴度為2×108TU/ml;Lenti-NK4轉(zhuǎn)染hBMSCs后熒光表達隨著時間延長及MOI值增加而增強、增多;攜帶NK4基因的hBMSCs(hBMSCs-NK4

9、)NK4表達正常,NK4分泌量隨著MOI值增加而增加,同時也隨感染時間延長而增加,最佳MOI值為50;MOI為50時,Lenti-NK4轉(zhuǎn)染hBMSCs的轉(zhuǎn)染率達87.8％,Lenti-GFP轉(zhuǎn)染hBMSCs的轉(zhuǎn)染率為96.5％。
　　 3、4×106MKN45細胞懸液接種與瘤組織塊接種皮下移植瘤成瘤率100％,后者成瘤時間明顯短于前者(P＜0.05);107個瘤組織勻漿細胞懸液腹腔注射,成瘤率100％。
　　 4、hB

10、MSCs對胃癌趨向性:(1)上室培養(yǎng)hBMSCs的各組中,MKN45、GES-1、空白對照組細胞數(shù)分別為239.5±54.3、43.57±4.6、37.3±4.7:MKN45組細胞數(shù)明顯高于GES-1組及空白對照組(P＜0.01),GES-1組與空白對照組無明顯差異(P＞0.05);上室培養(yǎng)hFB的各組中,MKN45、GES-1、空白對照組細胞數(shù)分別為27.7±16.7、16.4±5.1、19.1±6.2,三組相比均無顯著差異(P＞0.

11、05);下室均培養(yǎng)MKN45時,上室為hBMSCs組遷移至膜對側(cè)細胞數(shù)明顯高于上室為hFB組(P＜0.01),下室均培養(yǎng)GES-1時,上室為hBMSCs組遷移至膜對側(cè)細胞數(shù)明顯高于上室為hFB組(P＜0.05),下室均為空白培養(yǎng)基時,上室為hBMSCs組遷移至膜對側(cè)細胞數(shù)明顯高于上室為hFB組(P＜0.05)。(2)體內(nèi)實驗結(jié)果顯示注射hBMSCs-GFP的5只裸鼠,瘤體內(nèi)均可見散在綠色熒光,而注射hFB-GFP的裸鼠,瘤體內(nèi)未見綠色熒

12、光,注射Lenti-GFP的5只裸鼠,僅有1例瘤體內(nèi)可見散在熒光。hBMSCs-GFP組瘤體內(nèi)熒光表達率明顯高于與hFB-GFP及Lenti-GFP組(P＜0.01)。hBMSCs-GFP組1例肝臟(20％)及1例肺(20％)有散在熒光,與瘤體內(nèi)熒光表達率相比明顯低(P＜0.05),心、腎、脾中未見GFP表達(P＜0.01)。
　　 5、以hBMSCs為載體的NK4基因治療對胃癌治療效果:(1)hBMSCs-NK4對皮下移植瘤治

13、療結(jié)果顯示hBMSCs-NK4治療組瘤體體積均明顯小于hBMSCs-GFP及PBS組(P＜0.05);Lenti-NK4治療組瘤體體積在各時段與PBS組相比無顯著性差異(P＞0.05),在第3周時小于hBMSCs-GFP組(P＜0.05),其余時間與hBMSCs-GFP組相比無顯著性差異(P＞0.05);hBMSCs-NK4治療組抑瘤率達52.2％,Lenti-NK4治療組抑瘤率為29.4％。(2)hBMSCs-NK4組瘤重1.94±0

14、.67g,明顯低于hBMSCs-GFP組及PBS組(P＜0.05);Lenti-NK4組瘤重2.16±0.49g,低于hBMSCs-GFP組及PBS組瘤重,但無顯著性差異(P＞0.05);(3)hBMSCs-NK4組壞死評分3.63±0.47,明顯低于兩對照組(P＜0.05):Lenti-NK4組腫瘤壞死評分為3.25±0.38,與兩對照組相比無明顯差異(P＞0.05);(4)hBMSCs-NK4組微血管密度(microvessel d

15、ensity,MVD)為5.6±1.47,明顯低于hBMSCs-GFP和PBS組(P＜0.05),:Lenti-NK4組瘤組織MVD低于hBMSCs-GFP和PBS組,但三組相比均無顯著性差異(P＞0.05);(5)hBMSCs-NK4和Lenti-NK4組凋亡指數(shù)(Apoptotic index,AI)分別為7.31±1.90、4.2±1.3,對照組hBMSCs-GFP和PBS組A1分別為2.69±0.55、1.95±0.91,hBM

16、SCs-NK4組AI均顯著高于Lenti-NK4組及兩對照組(P＜0.01),Lenti-NK4組AI亦顯著高于兩對照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、采用全骨髓培養(yǎng)法可分離獲得高純度的hBMSCs;
　　 2、攜帶NK4的慢病毒能安全、有效地轉(zhuǎn)染hBMSCs,轉(zhuǎn)染后NK4基因可持續(xù)穩(wěn)定表達:
　　 3、hBMSCs在體內(nèi)外對胃癌均有明顯趨向性;
　　 4、hBMSCs為載體的NK4基