Ang-1基因修飾的Nestin陽(yáng)性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1)分離、培養(yǎng)及鑒定SD大鼠BMSCs，將其誘導(dǎo)分化為Nestin陽(yáng)性的BMSCs，并通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)將Ang-1基因轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)；(2)構(gòu)建SD大鼠T10脊髓鉗夾損傷模型，評(píng)估其可行性；(3)通過(guò)Ang-1基因修飾的Nestin陽(yáng)性BMSCs局部注射對(duì)損傷脊髓進(jìn)行治療，檢測(cè)Nestin陽(yáng)性的BMSCs是否能夠分化為神經(jīng)元細(xì)胞，檢測(cè)Ang-1對(duì)移植入體內(nèi)的Nestin陽(yáng)性的BMSCs，新生及損傷后殘留的神經(jīng)元細(xì)胞是否具有保護(hù)作

2、用。
　　 方法：(1)采用全骨髓差速貼壁分離培養(yǎng)法將SD大鼠雙后肢股骨、脛骨骨髓內(nèi)的BMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)。通過(guò)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)性狀；流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD45和CD90的表達(dá)；向成骨樣細(xì)胞、成脂肪樣細(xì)胞及成神經(jīng)樣細(xì)胞分化證明其具有多向分化潛能；同時(shí)將BMSCs誘導(dǎo)分化為Nestin陽(yáng)性的BMSCs，并通過(guò)腺病毒載體將Ang-1基因轉(zhuǎn)染入Nestin陽(yáng)性的BMSCs中，Weston blot

3、檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞是否表達(dá)Ang-1。(2)構(gòu)建SD大鼠T10脊髓鉗夾損傷模型，造模后1周內(nèi)通過(guò)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)、神經(jīng)電生理檢測(cè)及組織病理學(xué)檢測(cè)等方法檢測(cè)模型的可行性；(3)造模后1周對(duì)隨機(jī)分組的大鼠實(shí)施局部注射移植細(xì)胞進(jìn)行治療，在隨后的1～4周內(nèi)通過(guò)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)、神經(jīng)電生理檢測(cè)及脊髓組織的免疫組織化學(xué)檢測(cè)等方法檢測(cè)Ang-1基因修飾的Nestin陽(yáng)性BMSCs對(duì)損傷后脊髓的相關(guān)作用。
　　 結(jié)果：(1)通過(guò)全骨髓差速貼壁分離培養(yǎng)的B

4、MSCs增殖速度快，擴(kuò)增能力強(qiáng)，傳代培養(yǎng)3代后細(xì)胞可獲較高純度；通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物，細(xì)胞表達(dá)CD29和CD90，陽(yáng)性率均達(dá)99％以上；在體外通過(guò)誘導(dǎo)分化后細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞及成神經(jīng)樣細(xì)胞；通過(guò)Weston blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的Nestin陽(yáng)性BMSCs出現(xiàn)Ang-1條帶。(2)造模后1周內(nèi)，大鼠出現(xiàn)明顯截癱(BBB＜4分)，經(jīng)神經(jīng)電生理檢測(cè)無(wú)法引出CSEP波形，脊髓組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，脊髓空泡變性。(3

5、)移植后1～4周，A組大鼠后肢神經(jīng)功能無(wú)明顯變化，B、C組大鼠均有不同程度的恢復(fù)，C組較B組明顯(P＜0.05)；神經(jīng)電生理檢測(cè)，C組亦明顯優(yōu)于B組(P＜0.05)；損傷脊髓經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后，B、C兩組均表達(dá)BrdU、Nestin、NSE，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，但移植4周后C組仍保持一定量的陽(yáng)性細(xì)胞，且明顯多于A、B兩組(P＜0.05)。C組還可觀察到BrdU陽(yáng)性細(xì)胞向血管腔周圍聚集。
　　 結(jié)論：(1)通過(guò)全

6、骨髓差速貼壁分離培養(yǎng)法能夠獲取較高純度的BMSCs，細(xì)胞具有多向分化潛能，經(jīng)神經(jīng)誘導(dǎo)后，細(xì)胞能分化為Nestin陽(yáng)性BMSCs，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，Ang-1基因轉(zhuǎn)染入Nestin陽(yáng)性BMSCs中獲得成功。(2)成功構(gòu)建SD大鼠T10脊髓鉗夾型損傷模型。(3)經(jīng)Ang-1基因修飾后的Nestin陽(yáng)性BMSCs移植入體內(nèi)后能進(jìn)一步分化為成熟的神經(jīng)元細(xì)胞，同時(shí)其分泌的Ang-1對(duì)Nestin陽(yáng)性的BMSCs、新生及殘留神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，