VEGF基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦梗塞大鼠的實驗研究.pdf

1、目的：構(gòu)建VEGF基因表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察和檢測VEGF基因的轉(zhuǎn)染效果及其在MSCs中的表達(dá)，同時研究靜脈移植轉(zhuǎn)染VEGF基因的MSCs對腦梗塞大鼠的治療作用。
　　 方法：利用基因重組技術(shù)，用 EcoR I對含有目的基因VEGFA的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，獲得VEGFA基因片段，將其插入pIRES2-EGFP載體構(gòu)建pIRES2-EGFP-VEGFA真核表達(dá)載體，經(jīng)酶切、測

2、序鑒定正確，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pIRES2-EGFP-VEGFA導(dǎo)入MSCs，熒光顯微鏡下觀察及流式細(xì)胞術(shù)檢測其轉(zhuǎn)染率，Western Blot檢測VEGF基因的蛋白表達(dá)；另采取改良線栓法制作SD大鼠左側(cè)大腦中動脈栓塞模型（MCAO），隨機分為VEGF-MSCs組、MSCs組、PBS組、Model組，24h后前三組大鼠分別經(jīng)尾靜脈注射1ml VEGF-MSCs、MSCs、PBS，Model組不做任何處理。細(xì)胞移植7d后TTC染色觀察模

3、型大鼠腦梗死面積，免疫組織化學(xué)法檢測模型大鼠腦梗塞區(qū)域Ang-2、CD34的表達(dá)，并于細(xì)胞移植1d和7d對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。
　　 結(jié)果：(1)經(jīng)酶切、測序鑒定證實成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-VEGFA真核表達(dá)載體，其中插入有656bp的VEGFA cDNA，將其轉(zhuǎn)染MSCs后48h在熒光顯微鏡下觀察，可見帶綠色熒光的細(xì)胞，經(jīng)計算得到轉(zhuǎn)染率為(34±3.6)％，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)測定轉(zhuǎn)染率為(37±2.8)％。

4、Western Blot檢測證實VEGF基因在轉(zhuǎn)染后的MSCs中呈陽性表達(dá)；(2)NSS：細(xì)胞移植1天后，各組間均無明顯差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；7天后，VEGF-MSCs組、MSCs組較PBS組、Model組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中VEGF-MSCs組較MSCs組更低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Model組與PBS組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；(3)TTC檢測腦梗死體積百分比：VEG

5、F-MSCs組、MSCs組較PBS組、Model組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中VEGF-MSCs組較MSCs組更低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PBS組與Model組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。(4)免疫組化染色檢測腦梗塞區(qū)域Ang-2、CD34表達(dá)：VEGF-MSCs組、MSCs組較PBS組、Model組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中VEGF-MSCs組較MSCs組更高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（