慢病毒載體介導microRNA-1基因修飾骨髓間充質干細胞治療大鼠心肌梗死的實驗研究.pdf

1、目的:
　　通過攜帶miRNA-1的慢病毒載體(Lentivirus vector,LV)轉染大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymalstem cells),觀察miR-1過表達慢病毒載體轉染的BMSCs移植治療大鼠心肌梗死(Myocardia infarction,MI)的作用及其相關機制,以期為心肌梗死尋找新的治療策略。
　　方法:
　　以全骨髓培養(yǎng)法獲取 BMSCs,并予以擴增、鑒定;

2、構建攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的miR-1慢病毒載體并轉染BMSCs,建立miRNA-1基因修飾BMSCs(GFP作為細胞標記);通過冠狀動脈左前降支結扎法建立大鼠心肌梗死(AMI)模型。將30只大鼠通過隨機平分法分為空白對照組、假手術組(Sham組)、心肌梗死組( Vehic組)、未轉染病毒組( BMSCs組)、miR-1重組慢病毒組(miR-1/BMSCs組),每組6只,在AMI建模1天后,經尾靜脈注射途徑分別以100μl生理鹽水或

3、2×106/100μl相應BMSCs分別干預各實驗組并繼續(xù)飼養(yǎng)28天。分別于建模前及建模后28天超聲心動圖觀察心臟功能及結構改變;飼養(yǎng)28天后處死大鼠,留取血液標本酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各組血清血管內皮生長因子(VEGF)的濃度;留取心臟標本計算心臟左室質量指數(shù),伊紅-蘇木素(Hematoxylin Eosin,HE)染色觀察心肌病理變化,免疫組織化學方法(Immunohistochemistry,IHC)檢測血管Ⅷ因子表達;

4、免疫熒光檢測心肌細胞特異蛋白cTnT及connexin43的表達。
　　結果:
　　原代培養(yǎng)的 BMSCs48小時后有少量貼壁細胞,呈短棒狀或扁平多角形;最初3天細胞生長較慢,見少量小集落形成,之后快速增殖,流式細胞儀檢測BMSCs的表面標志性抗原顯示CD29、CD44陽性,而CD34、CD45陰性,符合BMSCs特征;成功構建miR-1過表達慢病毒載體(病毒滴度3×108TU/μl)并轉染BMSCs,四天時轉染效率達90％

5、以上并檢測到miR-1高水平表達。建模前各組大鼠超聲心動圖檢測指標無明顯差異,建模28天時BMSCs組及miR-1/BMSCs組超聲檢測指標較Vehic組改善,其中miR-1/BMSCs組改善尤為明顯。ELISA提示相較空白組及 Sham組,其他各組血清 VEGF濃度均明顯升高,其中miR-1/BMSCs組VEGF濃度升高最顯著;HE染色顯示其結構破壞及瘢痕形成均明顯輕于其他實驗組;血管Ⅷ因子免疫組織化學檢測同樣顯示miR-1/BMSC

6、s組毛細血管密度較其他各組顯著升高。免疫熒光檢測顯示miR-1/BMSCs組大鼠心肌梗死區(qū)部分BMSCs表達心肌細胞特異蛋白cTnT及connexin43。
　　結論:
　　心肌梗死后移植骨髓間充質干細胞能改善心肌梗死后SD大鼠心功能,并能一定程度抑制或逆轉心室重構,miR-1基因修飾BMSCs可進一步增強大鼠心肌梗死治療效果;miR-1基因修飾BMSCs可能通過提升BMSCs向心肌細胞分化效率及促進VEGF等有益因子旁分泌