Bcl-2基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦缺血大鼠突觸可塑性的影響。 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植對腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)及突觸可塑性的影響。 方法：采用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)大鼠MSCs，并進(jìn)行鑒定；大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組和MSCs組。線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)模型，缺血2h后再灌注。MSCs組24h后經(jīng)尾靜脈注射方式移植BrdU標(biāo)記的MSCs，PBS組尾靜脈

2、注射等體積的PBS作為對照。分別于術(shù)后1d、7d、14d、28d對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分(NSS)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察梗死灶周圍腦組織突觸素(SYN)的表達(dá)，RT-PCR檢測梗死灶周圍腦組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)mRNA的表達(dá)；應(yīng)用電鏡及免疫電鏡技術(shù)觀察MSCs移植后大鼠腦梗死灶周圍突觸結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果：密度梯度離心結(jié)合貼壁法能有效分離、純化大鼠MSCs，免疫組化結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞CD44、CD71表達(dá)陽性

3、，CD45表達(dá)陰性；和模型組及PBS組大鼠相比，MSCs組大鼠NSS明顯較低(P<0.05)，SYN的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，BDNF mRNA也較高；電鏡檢查示MSCs組大鼠突觸界面曲率較大，突觸后致密物質(zhì)的厚度增加，突觸間隙寬度變窄，突觸活性帶長度增加；免疫電鏡示BrdU 陽性細(xì)胞和宿主腦神經(jīng)元形成非成熟的突觸樣結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：尾靜脈移植MSCs 能改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與移植的MSCs 通過神經(jīng)營養(yǎng)效應(yīng)調(diào)

4、節(jié)腦缺血周圍神經(jīng)細(xì)胞的可塑性及形成新的突觸有關(guān)。 第二部分、Bcl-2基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外模擬缺血性損傷的保護(hù)作用。 目的：觀察Bcl-2基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）體外模擬缺血性損傷的保護(hù)作用，為Bcl-2基因修飾的MSCs 移植治療腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 方法：采用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠MSCs，對培養(yǎng)第5代的MSCs進(jìn)行鑒定；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對MSCs進(jìn)行人Bcl-2(h

5、Bcl-2)基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后用G418進(jìn)行篩選，然后用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測其蛋白的表達(dá)；采用血清剝奪和缺氧(SOD)處理建立MSCs體外模擬缺血性損傷模型，通過流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測評價轉(zhuǎn)染hBcl-2基因的MSCs和未轉(zhuǎn)染的MSCs的凋亡及存活情況。 結(jié)果：密度梯度離心結(jié)合貼壁法能有效分離、純化大鼠MSCs，免疫組化結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞CD44、CD71表達(dá)陽性，而CD45表達(dá)陰性；轉(zhuǎn)染hBcl-2基因的MS

6、Cs經(jīng)G418篩選后有hBcl-2蛋白的穩(wěn)定、高效的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：和MSCs相比，轉(zhuǎn)染hBcl-2基因的MSCs在SOD 后6h及9h凋亡細(xì)胞較少，存活細(xì)胞較多。TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測也示轉(zhuǎn)染hBcl-2基因的MSCs的凋亡明顯減少(p<0.05)。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染hBcl-2基因的MSCs 有其蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，hBcl-2基因轉(zhuǎn)染可對抗MSCs體外模擬缺血性損傷引起的細(xì)胞凋亡從而具有保護(hù)作用。 第三部分、B

7、cl-2基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦缺血大鼠的治療作用。 目的：觀察Bcl-2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植對大鼠腦缺血性損傷的治療作用及對移植的MSCs保護(hù)作用。 方法：采用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠MSCs，對培養(yǎng)的MSCs 進(jìn)行人Bcl-2(hBcl-2)基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后用G418進(jìn)行篩選。大鼠隨機(jī)分為Model組、MSCs組和Bcl-2-MSCs組。線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血(MCAO

8、)模型，缺血2h后再灌注。MSCs組及Bcl-2-MSCs組在缺血24h后經(jīng)尾靜脈注射方式移植BrdU 標(biāo)記的MSCs及hBcl-2基因修飾的MSCs。分別于術(shù)后1d、7d、14d、28d對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分(NSS)；在腦缺血14d應(yīng)用TTC法觀察腦梗死灶體積；BrdU和TUNEL免疫熒光雙重標(biāo)記檢測移植的MSCs凋亡情況；Western blot檢測大鼠腦梗死周邊區(qū)Bcl-2蛋白的表達(dá)；HE染色觀察腦組織病理形態(tài)。

9、 結(jié)果：MSCs-Bcl-2組和MSCs組NSS評分、腦梗死體積百分比、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較Model組低(P<0.05)；和MSCs組相比，MSCs-Bcl-2組NSS評分、腦梗死體積百分比、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)更低，BrdU陽性細(xì)胞數(shù)較多（P<0.05）；MSCs-Bcl-2組BrdU和TUNEL 免疫熒光雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)稍多，但差異不顯著（P>0.05）；而MSCs-Bcl-2組BrdU和TUNEL免疫熒光雙標(biāo)細(xì)胞占BrdU陽性細(xì)胞百

10、分比明顯較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在腦缺血后不同時間點(diǎn)，MSCs組Bcl-2蛋白的表達(dá)水平很低，而MSCs-Bcl-2組Bcl-2蛋白呈持續(xù)較高水平的表達(dá)，和MSCs組同時間點(diǎn)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HE染色示MSCs組和MSCs-Bcl-2組腦組織損傷及細(xì)胞丟失較Model組輕，MSCs-Bcl-2組減輕更明顯，兩組腦梗死周邊區(qū)均未見到核大、濃染的異形細(xì)胞。 結(jié)論：Bcl-2基因修飾的MSCs