2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、前言:PAK(p21 activated kinase)為一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,通過其下游眾多的激酶底物和結合蛋白參與眾多的生物學功能。目前被認為是腫瘤細胞信號網絡的關鍵調節(jié)因子。迄今鑒定的PAK家族成員包括六個成員:PAK1-PAK6,根據(jù)結構相似性分為兩類,Ⅰ類包括PAK1-3,Ⅱ類包括PAK4-6。兩類PAK在結構上包括N末端保守的PBD結構域(p21 binding domain)和C末端保守的激酶域(kinase

2、domain,KD)。
   PAK4是Ⅱ類PAK中最早被鑒定的,也是Ⅱ類PAK中最具有代表性的成員μ。與其他PAK家族成員一樣,PAK4與Ⅰ類PAK不同的是N末端不含有自我抑制域(auto inhibitory domain,AID)因此兩類PAK在活化方式和生物學功能上有所區(qū)別。PAK4在大多數(shù)組織中均有表達,在前列腺、睪丸及結腸中表達最高。重要的是PAK4在眾多腫瘤細胞系中有過表達,并且其定位于19號染色體的基因在人結腸、

3、卵巢及胰腺腫瘤中有擴增現(xiàn)象。在對人大腸癌340種絲氨酸/蘇氨酸激酶突變篩查中發(fā)現(xiàn)了2個PAK4的基因突變。研究發(fā)現(xiàn),激活型的PAK4可以導致腫瘤細胞的錨定非依賴性生長,而失活型的PAK4突變體(PAK4NE)則顯著抑制了Ras引起的細胞轉化。雖然PAK4是Ⅱ類PAK中研究的最為廣泛的成員,但是目前發(fā)現(xiàn)的PAK4相互作用蛋白仍然十分有限,對PAK4的研究仍處于起步階段。通過與Rho家族GEF-H1(guanine nucleotide e

4、xchange factor H1)相互作用,PAK4可引起細胞形態(tài)改變。PAK4通過與G蛋白偶聯(lián)的Rho-GEF直接的相互作用,下調Rho活性,顯著減少了Rho的GTP結合形式,進一步減少了血清或LPA刺激的應力纖維的形成。PAK4通過與整合素αvβ5的相互作用,選擇性的促進整合素αvβ5介導的細胞遷移。有報道證實LIMK1可以作為PAK1的磷酸化底物,最近研究證實,PAK4也可以磷酸化LIMK1。而活化的LIMK1可以磷酸化cofi

5、lin,有研究發(fā)現(xiàn)PAK4引起的細胞形狀改變依賴cofilin的磷酸化,這表明對LIMK1活性的調節(jié)對于細胞移動是必須的,同時也說明PAK4,LIMK1和cofilin之間存在著功能上的關聯(lián)。但對于PAK4引起的細胞遷移,仍然有很對機制等待研究。因此我們利用酵母雙雜交技術從人胎腦文庫中篩選出若干PAK4相互作用蛋白,我們選擇了2個與腫瘤侵襲轉移及細胞骨架相關的進行了研究,希望對PAK4促進腫瘤細胞骨架重組及腫瘤細胞遷移的作用及機制進行探

6、討。它們分別為DGCR6L和PKN1。
   DGCR6L是我們利用酵母雙雜交篩選出來的新的PAK4相互作用蛋白。GCR6L(DiGeorge critical region6 like)基因定位于染色體22q11,存在兩個高度同源的拷貝(DGCR6和DGCR6L),最初發(fā)現(xiàn)在velo-cardio-facial syndrome/DiGeorgesyndrome(VCFS/DGS)中缺失。兩個基因高度同源,翻譯的蛋白質均含有2

7、2個氨基酸殘基,且保守度達97%。DGCR6L在乳腺癌中高表達,并于腫瘤轉移相關,但具體機制不詳。本研究中,我們將對PAK4與DGCR6L的相互作用進行驗證,并探索DGCR6L在PAK4引起的胃癌細胞遷移中的作用和機制。
   PKN1為RhoA和Rac1的下游靶蛋白,調節(jié)細胞骨架重組及細胞遷移。蛋白激酶C相關激酶1(PKC-related kinase1,PRK1)也稱為PKN或PKN1。是脂質和RhoGTPase激活的絲氨酸

8、/蘇氨酸激酶,為PKC超家族一員,分子量為116KD。目前發(fā)現(xiàn),該家族有三個成員,分別為PKN1、PKN2及PKN3,三者結構相似,其中PKN1與PKN2的同源性為58%。PKN1的N末端(aal~560)包含三個重復亮氨酸拉鏈樣結構域,與蛋白質相互作用有關。C末端(aa561~942)有一個與蛋白激酶C(PKC)高度同源的催化結構域,與激酶活化有關。
   PKN1的N末端含有兩個同源重復序列,HR1和HR2域。HR1域內含有

9、三個重復亮氨酸拉鏈樣結構,呈反向平行卷曲排列(anti-parallel coiled-coil),也稱ACC重復序列,分別為HR1a(ACC1),HR1b(ACC2)及HR1C(ACC3)。研究表明,RhoA能與PKN1的HR1a和HR1b結合,而不與HR1C結合。結合了GTP的RhoA即活化的RhoA只與HR1a(ACC1)結合,而結合了GTP的Rac1只與PKN1的HR1b區(qū)域(ACC2)結合。
   一些實驗證據(jù)表明,P

10、RK1/PRK2作為RhoA和Rac1的下游靶蛋白或效應器,通過與RhoA和Rac1的相互作用在細胞骨架重組及細胞遷移中發(fā)揮作用。例如,RhoA和Rac1與PKN2結合并激活PKN2.在NIH3T3成纖維細胞中導入無激酶活性的PKN2突變體,會引起肌動蛋白應力纖維降解,說明PKN2激酶活性可以調節(jié)細胞骨架重組。PI3K下游靶蛋白PDK1能直接激活PKN1,介導胰島素所致的肌動蛋白細胞骨架重組,應力纖維解聚,片狀偽足形成。
  

11、實驗材料及方法
   酵母配合實驗(yeast mating assay)檢測DGCR6L與PAK4的相互作用。DGCR6L全長cDNA克隆到pGADT7載體后轉染至Y187酵母細胞,與轉染pGBKT7-PAK4N/C的AH109酵母細胞進行配合實驗,配合子接種于SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/x-α-gal培養(yǎng)板培養(yǎng),生長并變藍為陽性克隆。
   蛋白質體外結合實驗(GST pull-down assay

12、)證實PAK4與DGCR6L或PKN1的相互作用,并尋找相互作用區(qū)域。pCDNA3.1C-PAKs進行體外轉錄翻譯同時摻入35S-methonine,得到35S-PAKs;與體外純化的GST-DGCR6/L或GST-PKN1 s融合蛋白進行GST pull-down實驗;通過構建相應蛋白的截短蛋白,利用GST-pulldown實驗檢測蛋白相互作用的區(qū)域。
   免疫共沉淀(Immunoprecipitation)/免疫印跡(we

13、stern blot)驗證蛋白在哺乳動物細胞內的相互作用。免疫熒光檢測蛋白在細胞內的定位或者是相互作用蛋白在細胞內的共定位。我們利用融合的熒光蛋白或者免疫熒光檢測蛋白在細胞內的定位。GFP或DsRed融合的蛋白通過脂質體轉染到細胞,然后利用激光共焦掃描顯微鏡檢測蛋白在細胞內的定位。細胞內源性蛋白的定位通過免疫熒光的方式檢測。細胞內的微絲和微管分別利用特異性的結合蛋白進行標記。利用激光共焦掃描顯微鏡檢測蛋白在細胞內的定位。
  

14、DGCR6/L穩(wěn)定表達細胞系建立用于細胞遷移實驗。將pCDNA3.1C-DGCR6/L轉染AGS細胞,利用G418進行篩選,得到DGCR6/L穩(wěn)定表的的AGSDGCR6/L細胞。
   Transwell小室細胞遷移實驗驗證胃癌細胞的遷移能力改變。在PAK4和DGCR6L蛋白過表達或沉默表達條件下,檢測細胞遷移能力變化。3次以上的實驗結果進行統(tǒng)計學分析。
   激酶反應檢測PAK4對DGCR6L或PKN1的磷酸化。利用體

15、外激酶反應,檢測PAK4對DGCR6L、β-actin及PKN1的磷酸化;利用體外激酶反應檢測PKN1對PAK4的磷酸化。
   結果
   1.利用酵母配合實驗,DGCR6L與PAK4C發(fā)生相互作用;體外結合實驗證實,PAK4特異性的與DGCR6L結合。
   2.PAK4通過其466-572aa區(qū)域與DGCR6L結合,并且DGCR6L的基酸殘基6G,14G,115L在結合中起重要作用。
   3.PA

16、K4與DGCR6L在胃癌細胞SGC-7901中相互作用并有共定位,但不直接結合。
   4.PAK4在胃癌細胞SGC7901中與β-actin形成復合體,但經檢測沒有直接結合且PAK4不磷酸化β-actin;DGCR6L對于PAK4與β-actin形成復合體是必須的。
   5.PAK4、DGCR6L和肌動蛋白微絲在SGC-7901細胞中兩兩共定位;DGCR6L可以劑量依賴性的促進細胞內LIMK1及cofilin的磷酸化

17、水平。
   6.穩(wěn)定表達的DGCR6L促進胃癌細胞的遷移;沉默DGCR6L表達后細胞遷移能力下降,在此基礎上沉默PAK4表達細胞的遷移能力進一步下降。
   7.PAK4通過其激酶域與PKN1的HR2結構域結合。
   8.PKN1磷酸化PAK4,磷酸化位點位于PAK4的1-118aa。
   9.PKN1和PAK4在胃癌細胞SGC-7901內有共定位,且二者分別可以定位于高爾基復合體。
  

18、10.PKN1的表達使PAK4定位于細胞的肌動蛋白微絲,且三者有共定位。
   11.PKN1和PAK4與細胞的微管有共定位。
   結論:
   1.DGCR6L和PKN1分別是PAK4新的相互作用蛋白。
   2.DGCR6L通過促進LIMK1磷酸化水平調節(jié)細胞肌動蛋白骨架促進腫瘤細胞遷移。
   3.PKN1磷酸化PAK4的N-末端,且位點位于1-201aa區(qū)域。
   4.PKN1

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