POLD1-siRNA對細胞骨架及細胞遷移的影響.pdf

1、DNA聚合酶d(DNA polymerase delta, Pold)是真核生物DNA復(fù)制過程中主要的復(fù)制酶之一，在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)方面起著重要的作用。Pold由POLD1基因編碼，其p125催化亞基上具有聚合酶活性和外切酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，POLD1基因異常表達與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著直接的關(guān)系，但POLD1與腫瘤遷移相關(guān)性的作用并不清楚。本研究采用小RNA干擾(small RNA interfering)技術(shù)，靶向敲低HeLa、HU

2、VEC和Chang Liver細胞中POLD1基因的表達，檢測了POLD1-siRNA對HeLa、HUVEC、Chang Liver3株細胞骨架分布的影響，初步探討了POLD1-siRNA誘導(dǎo)HeLa、HUVEC、Chang Liver3株細胞骨架與細胞遷移的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.設(shè)計合成針對人POLD1基因的2條siRNA序列(POLD1-siRNA1、2)。取對數(shù)生長期細胞用于實驗，采用MTT法檢測POLD1-s

3、iRNA對細胞活力的影響;劃痕實驗檢測細胞遷移能力。
　　2.POLD1-siRNA轉(zhuǎn)染細胞72 h后，倒置顯微鏡觀察活細胞形態(tài)。
　　3.免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架中微管、微絲和中間絲及其相關(guān)蛋白a-Tubulin、γ-Tubulin、 F-actin、Cortactin、FilaminA、Vimentin、LaminB等在細胞中的分布及表達量。
　　4.免疫熒光染色觀察黏著斑相關(guān)蛋白Paxillin

4、、FAK、Src在細胞中的分布及表達量。
　　5.免疫熒光染色觀察細胞遷移中信號蛋白p125、Rho、 Cdc42等在細胞的分布及表達量，Western Blot技術(shù)檢測p125、β-actin等蛋白表達量。
　　結(jié)果:
　　1.POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC和Chang Liver細胞72h后，對HeLa、HUVEC細胞的抑制率分別為11.38％、12.11％，與對照組相比，細胞的活力顯著下降(p＜

5、0.05);對Chang Liver細胞的抑制率為21.32％，細胞活力極顯著下降(p＜0.01)。
　　POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC和Chang Liver細胞后，對HeLa細胞的抑制率為17.85％，細胞活力極顯著降低(p＜0.01);但對HUVEC和Chang Liver細胞活力沒有顯著性差異(p＞0.05）。
　　2.劃痕實驗顯示:與對照組相比，POLD1-siRNA轉(zhuǎn)染細胞后，在48h前抑制He

6、La細胞遷移，48h后抑制能力減弱，有促進遷移的趨勢;HUVEC細胞的劃痕修復(fù)速度加快，遷移能力增強;而Chang Liver細胞的劃痕修復(fù)能力明顯減慢，遷移能力下降。
　　3.POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC細胞72h后，細胞呈瘦長型，微管呈束狀，不對稱分布，細胞遷移前緣中微管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，數(shù)量增多，決定細胞遷移的方向。細胞膜處微絲聚集、延伸，使細胞膜表面突起，形成絲狀偽足、片狀偽足，誘導(dǎo)細胞遷移。高表達的Vimen

7、tin是細胞遷移的標志，本實驗研究結(jié)果顯示Vimentin的表達量增加，促進細胞遷移。但POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染Chang Liver細胞72h后，細胞中微管為致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，微絲解聚呈彌散狀，Vimentin的表達量顯著下降，抑制細胞遷移。
　　POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC細胞72h后，細胞呈不規(guī)則形狀，出現(xiàn)絲狀偽足和片狀偽足，微管集中分布于細胞前緣，細胞質(zhì)中的微絲解聚，細胞膜處微絲聚合，誘導(dǎo)細胞遷移。V

8、imentin在HUVEC細胞中表達量增加，促進HUVEC細胞遷移。但POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染ChangLiver細胞72h后，細胞邊緣出現(xiàn)片狀偽足，但細胞質(zhì)和細胞膜處微絲解聚，含量降低，同時Vimentin的含量極顯著下降，抑制細胞遷移。
　　4.POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC細胞72 h后，兩株細胞中FAK、Src的表達量升高，激活的FAK-Src復(fù)合物使Paxillin磷酸化，促進細胞遷移，同時HeLa

9、細胞中FAK激活后進入細胞核中參與細胞遷移活動的調(diào)節(jié)。
　　POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染HeLa、HUVEC細胞72h后，F(xiàn)AK、Src在兩株細胞中的含量顯著增加，促進細胞遷移。但FAK在HUVEC細胞的含量降低，說明POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染HUVEC細胞沒有激活FAK。
　　5.POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染HeLa、 HUVEC細胞72 h后，兩株細胞中Rho的表達量都增加，調(diào)節(jié)應(yīng)力纖維和片狀偽足的形成，同時HeLa細

10、胞中激活的Rho進入細胞核，共同促進細胞遷移。POLD1-siRNA1轉(zhuǎn)染Chang Liver細胞72h后，細胞中Rho的含量降低，抑制細胞遷移。
　　POLD1-siRNA2轉(zhuǎn)染HeLa細胞72h后，Rho表達量增加、活化，促進細胞遷移。
　　在HUVEC細胞中Rho的表達量降低，可能Rho沒參與細胞遷移的調(diào)節(jié)。但Chang Liver細胞中Rho的含量顯著下降，抑制細胞遷移。
　　結(jié)論:POLD1-siRNA1能

11、夠使細胞中FAK和Src的含量增加，從而激活FAK-Src復(fù)合物的活性，同時Paxillin蛋白被磷酸化，進而調(diào)節(jié)HeLa、HUVEC細胞前緣黏著能力增強，細胞后緣黏著斑與細胞外基質(zhì)去黏附，誘導(dǎo)細胞遷移。
　　POLD1-siRNA2處理HeLa和HUVEC細胞后，僅HeLa細胞是通過FAK-Src通路激活，促進細胞遷移。HUVEC細胞中FAK表達量下降未活化。
　　POLD1-siRNA1通過小G蛋白Rho調(diào)節(jié)細胞HeLa