KIF4A影響胃癌細(xì)胞遷移侵襲潛在作用機(jī)制的研究.pdf

1、胃癌是目前我國比較常見的惡性疾病之一，死亡率居各類癌癥的第二位，成為嚴(yán)重威脅人類身體健康的重大疾病。雖然有關(guān)胃癌更好治療方案的科學(xué)研究成果越來越多，但病人的5年存活率依然很低，特別是發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性程度比較高的胃癌患者。由于以上原因，越來越多的新型生物靶點(diǎn)成為胃癌的病因?qū)W和組織病理學(xué)的研究對象，這些科學(xué)研究對嚴(yán)重威脅生命的胃癌疾病的早期診斷、有效治療具有長遠(yuǎn)意義。
　　染色體驅(qū)動蛋白KIF4A在細(xì)胞周期的有絲分裂過程中始終保持與染色

2、體臂結(jié)合。整個蛋白分子由1232個氨基酸組成，分子量約為140kDa，由球狀的馬達(dá)結(jié)構(gòu)域、頸部的桿狀區(qū)和尾部三部分組成。球狀的馬達(dá)結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合微管并朝向微管正極運(yùn)動，頸部的桿狀區(qū)主要幫助蛋白分子形成多聚體，該分子的尾部主要負(fù)責(zé)結(jié)合所運(yùn)輸?shù)摹柏浳铩?。KIF4A作為一種多功能動力蛋白分子，可以參與細(xì)胞有絲分裂過程中紡錘體的形成，染色體的凝集與分離，腦神經(jīng)元的發(fā)育與再生，DNA的損傷應(yīng)答，免疫細(xì)胞的活化，細(xì)胞骨架微管動態(tài)不穩(wěn)定性的調(diào)控，細(xì)胞

3、內(nèi)的大分子運(yùn)輸?shù)取IF4A蛋白分子的功能多樣性使該蛋白分子必然與人類各種重大疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　眾所周知，臨床腫瘤的轉(zhuǎn)移與多種因素相關(guān)，其中腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的改變直接影響腫瘤的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移過程。而腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲與細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器及蛋白分子的重新分布以及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重新排列密切相關(guān)。驅(qū)動蛋白分子家族既是多種蛋白分子或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的工具，又參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)微管的動態(tài)不穩(wěn)定性，直接影響細(xì)胞骨架的改變，因此與腫瘤細(xì)

4、胞的遷移侵襲緊密相關(guān)。KIF4A作為驅(qū)動蛋白分子，對胃癌細(xì)胞遷移侵襲能力的調(diào)控可能主要表現(xiàn)在以下兩個方面:一是KIF4A直接抑制細(xì)胞內(nèi)微管遠(yuǎn)端(正極）的動態(tài)不穩(wěn)定性，從而影響細(xì)胞骨架微管的結(jié)構(gòu)重排，進(jìn)而影響細(xì)胞的遷移侵襲能力;二是KIF4A負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)黏著斑蛋白Supervillin(SVIL)，進(jìn)而影響細(xì)胞遷移侵襲過程中黏著斑結(jié)構(gòu)的形成，最終抑制細(xì)胞的遷移侵襲過程。
　　本研究工作主要從以下幾個方面展開:
　　1.應(yīng)用分子克隆

5、技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒pGEXKG-SVILC302和pHIS8-SVILC302，然后誘導(dǎo)表達(dá)及純化GST-SVILC302融合蛋白，并將該蛋白作為免疫原皮下注射新西蘭大白兔，得到免疫血清;將HIS-SVILC302蛋白與Ni-NTA鎳離子金屬螯合柱進(jìn)行交聯(lián)，對SVIL多克隆抗體進(jìn)行純化。
　　2.為驗(yàn)證KIF4A對胃癌細(xì)胞遷移侵襲能力的負(fù)調(diào)控機(jī)制之一:直接抑制細(xì)胞內(nèi)微管遠(yuǎn)端（正極）的動態(tài)不穩(wěn)定性，從而影響細(xì)胞骨架微管的結(jié)構(gòu)重排，進(jìn)而影響

6、細(xì)胞的遷移侵襲能力。我們通過免疫熒光染色技術(shù)鑒定了KIF4A蛋白分子定位于微管末端。
　　3.為驗(yàn)證KIF4A對胃癌細(xì)胞遷移侵襲能力的另一個負(fù)調(diào)控機(jī)制:負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)黏著斑蛋白SVIL，進(jìn)而影響細(xì)胞遷移侵襲過程中黏著斑結(jié)構(gòu)的形成，最終抑制細(xì)胞的遷移侵襲過程。我們通過免疫共沉淀技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)證實(shí)了KIF4A與SVIL結(jié)合且共定位。
　　4.通過對瞬時敲降、過表達(dá)KIF4A蛋白分子的細(xì)胞和穩(wěn)定敲降KIF4A的細(xì)胞株中Vincu