小鼠Foxp3重組蛋白的表達(dá)、多抗制備及Foxp3在小鼠1型糖尿病模型中的表達(dá)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3，并轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，以純化蛋白為抗原免疫新西蘭兔制備抗小鼠Foxp3的多克隆抗體，對(duì)抗體進(jìn)行滴度及特異性的分析。以制備的抗體為一抗Western-blot檢測(cè)小鼠1型糖尿病模型脾細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究Foxp3奠定了基礎(chǔ)。 方法： (1) 小鼠Foxp3重組蛋白的表達(dá)、純化和多抗制備 軟件分析小鼠Foxp

2、3基因，選取第532～1008bp位堿基序列為目的基因，其編碼產(chǎn)物159aa具有強(qiáng)抗原性及高特異性。以pMIGR1/ Foxp3重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增目的片斷，將目的片斷克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6p-2，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3，經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western-Blot 鑒定表達(dá)產(chǎn)物；對(duì)重組融合蛋白（目的蛋白和GST蛋白）進(jìn)

3、行大量誘導(dǎo)表達(dá)，用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱純化，SDS-PAGE和Western-Blot 分析和鑒定純化蛋白，采用BCA試劑盒測(cè)定純化蛋白濃度；用純化的重組融合蛋白免疫新西蘭兔，制備抗血清；采用 ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)；利用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染pMIGR1/Foxp3及pMIGR1入NIH3T3細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白, 以制備的多抗為一抗進(jìn)行Western-blot法檢測(cè)NIH3T3轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的Foxp3，對(duì)制備的多抗進(jìn)行特異

4、性分析。 (2) Foxp3在小鼠1型糖尿病模型中的表達(dá)研究 用STZ誘導(dǎo)小鼠1型糖尿病模型，嚴(yán)密觀察飲食情況，定期稱體重，測(cè)量尿糖及血糖變化，制作胰腺、胃黏膜及甲狀腺組織的病理切片以觀察其病理改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量的變化；RT-PCR、半定量Western-blot分別在mRNA、蛋白水平檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)。 結(jié)果： PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)477bp的目

5、的片斷；構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定證明其中插入片段為目的基因；含pGEX-6p-2/Foxp3重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，得到一分子量約45kDa的重組融合蛋白GST-Foxp3，用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱對(duì)重組融合蛋白進(jìn)行純化；Western-blot鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白及純化蛋白能被抗GST單抗識(shí)別，在45kDa附近有特異條帶，與預(yù)期融合蛋白大小一致；以純化的Foxp

6、3重組融合蛋白為抗原免疫新西蘭兔制備抗Foxp3抗體，ELISA法檢測(cè)所得抗體效價(jià)在1∶12 800以上，Western-blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pMIGR1/Foxp3的NIH3T3細(xì)胞總蛋白能被抗小鼠Foxp3多抗特異性識(shí)別，而轉(zhuǎn)染pMIGR1的NIH3T3細(xì)胞總蛋白未出現(xiàn)任何條帶；STZ 誘導(dǎo)的小鼠1型糖尿病模型組與正常組及對(duì)照組相比，有明顯的多飲、多食、多尿和體重減輕等典型的糖尿病表現(xiàn)；模型鼠在造模1月后出現(xiàn)不同程度的尿糖改變，血

7、糖水平也顯著升高，胰島有不同程度的胰島炎性改變，而其它兩組尿糖均陰性，血糖水平正常，胰島未發(fā)生病理改變；流式分析T淋巴細(xì)胞亞群在小鼠脾細(xì)胞中的比例在各組之間變化明顯，用STZ致誘小鼠糖尿病后，CD4+T細(xì)胞顯著升高，而CD4+CD25+T細(xì)胞在模型組小鼠脾細(xì)胞中的比例也較正常組及對(duì)照組稍有升高，但是模型組CD4+CD25+T與CD4+T細(xì)胞的比值較正常組及對(duì)照組顯著偏低；RT-PCR檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)水平，模型組

8、小鼠的脾細(xì)胞中Foxp3 mRNA的表達(dá)與內(nèi)參（G3PDH）的比稍高于正常組及對(duì)照組；半定量Western-blot 結(jié)果顯示模型組的脾細(xì)胞中Foxp3在蛋白水平的表達(dá)量亦稍高于正常組及對(duì)照組。 結(jié)論： (1)成功構(gòu)建了pGEX-6p-2/Foxp3原核表達(dá)載體，其在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)出一分子量約為45kDa的重組融合蛋白； (2)誘導(dǎo)表達(dá)的重組融合蛋白具有較好的免疫原性，能刺激新西蘭兔產(chǎn)生高效