叉頭狀轉錄因子Foxp3重組腺病毒的構建及鑒定.pdf

1、Foxp3是叉頭樣轉錄因子(Forkheadtranscriptionfactor)P亞家族的新成員。目前研究證實該基因特異性表達于固有CD4+CD25+調節(jié)性T細胞，并在該細胞的發(fā)育和功能維持中起重要作用，是CD4+CD25+調節(jié)性T細胞特異性標志物之一，并作為轉錄抑制因子參與免疫應答的調控。Foxp3包含叉頭狀結構域、C2H2鋅指結構及亮氨酸拉鏈等保守序列，在與靶基因啟動子和某些蛋白質結合上起著重要作用。 近年來，人們通過構

2、建Foxp3重組逆轉錄病毒、Foxp3轉基因模型等方法對該基因的作用機制及臨床應用展開了廣泛的研究。實驗發(fā)現(xiàn)Foxp3的異位表達在體外可誘導與固有CD4+CD25+調節(jié)性T細胞表型及作用相似的調節(jié)性T細胞的產(chǎn)生；誘導產(chǎn)生的調節(jié)性T細胞在體內可直接或間接抑制效應性T淋巴細胞、B淋巴細胞及某些抗原提呈細胞(如樹突狀細胞)等的增殖、分化和免疫應答，誘導體內免疫耐受的產(chǎn)生，對治療某些自身免疫病及移植排斥反應有一定效果；隨著研究的深入，該基因在腫

3、瘤免疫的作用也越來越受到關注，有文獻報道在某些腫瘤組織及周圍淋巴結等處發(fā)現(xiàn)Foxp3的表達，為腫瘤逃逸機制的研究以及新型靶向制劑的開發(fā)提供了新思路。 為更深入研究Foxp3的作用機制及誘導免疫耐受方面的應用，本實驗利用AdEasyTMXL系統(tǒng)構建攜帶Foxp3的重組腺病毒，并行初步鑒定。方法：從小鼠胸腺組織獲取約1.3kb大小的目的基因，克隆至穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-1構建重組穿梭載體；PmeⅠ線性化重組

4、穿梭質粒電轉化BJ5183-AD-1感受態(tài)細菌，以細菌內同源重組方式完成腺病毒骨架與穿梭質粒的同源重組，構建攜帶Foxp3的重組腺病毒質粒；經(jīng)人胚胎腎細胞(AD293)包裝后產(chǎn)生復制缺陷的重組腺病毒Ad-Foxp3。提取感染重組腺病毒的AD293細胞總RNA及總蛋白，以RT-PCR及WesternBlot檢測Foxp3mRNA和蛋白的表達。病毒擴增三代后，用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(tissuecultureinfectiousdose50，

5、TCID50)方法測定重組腺病毒的滴度。最后，用HeLa細胞對野生型腺病毒進行檢測。結果：重組腺病毒Ad-Foxp3轉染AD293細胞3天后可觀察到綠色熒光蛋白(hrGFP)的表達，6～7天后，大部分細胞出現(xiàn)腫脹、脫落等細胞致病變效應(CPE)；RT-PCR檢測表明Foxp3在AD293細胞可正確轉錄；WesternBlot檢測顯示Foxp3表達蛋白可與小鼠Foxp3IgG單克隆抗體特異性結合，而且分子量大小與預期一致；擴增三代后，病毒