糙皮側(cè)耳產(chǎn)孢相關(guān)基因stpo1的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、糙皮側(cè)耳（P.ostreatus）是我國(guó)栽培量最廣、消費(fèi)量最大的食用菌。糙皮側(cè)耳子實(shí)體成熟過(guò)程中會(huì)彈射大量孢子，數(shù)量巨大的孢子不僅會(huì)降低子實(shí)體的品質(zhì)，還會(huì)引起菇農(nóng)的―蘑菇肺‖。選育無(wú)孢糙皮側(cè)耳菌株對(duì)解決孢子引起的過(guò)敏反應(yīng)具有重要作用。
　　本文將肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）產(chǎn)孢相關(guān)基因stpo1的基因序列，與糙皮側(cè)耳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到糙皮側(cè)耳中與其同源的基因，并將獲得的基因命名為stpo1。通過(guò)反

2、轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的方法，克隆得到了stpo1的CDS全長(zhǎng)序列；對(duì)目的基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)stpo1進(jìn)行表達(dá)模式分析；利用pEASY-E2原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)stpo1進(jìn)行原核表達(dá)；構(gòu)建了糙皮側(cè)耳stpo1過(guò)表達(dá)以及RNA干擾表達(dá)載體，以期通過(guò)對(duì)stpo1基因過(guò)表達(dá)或者沉默來(lái)研究stpo1基因與糙皮側(cè)耳孢子形成的關(guān)系。本文主要研究結(jié)果如下：
　　1、以糙皮側(cè)耳子實(shí)體為材料，采用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆出糙皮側(cè)耳產(chǎn)孢

3、相關(guān)基因stpo1的CDS區(qū)（長(zhǎng)度為2,556bp）；并以基因組為模板克隆出該基因的gDNA（長(zhǎng)度為3,853bp）。Genbank登錄號(hào)為KR822419。對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因擁有25個(gè)內(nèi)含子。stpo1與stpp1、PC9v1.0同源基因、PC15v2.0同源基因的CDS區(qū)核酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，stpo1與上述三個(gè)同源基因分別具有88％、97%、99%的一致性。
　　2、STPO1蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白屬于

4、DNA錯(cuò)配修復(fù)MSH家族基因，具有該家族蛋白中典型的MutS結(jié)構(gòu)域、ATP結(jié)合位點(diǎn)、P-Loop。STPO1蛋白的GO功能分析顯示，STPO1蛋白具有DNA錯(cuò)配修復(fù)的功能，能夠在ATP供能的情況下，識(shí)別并結(jié)合DNA錯(cuò)配位點(diǎn)，然后對(duì)其進(jìn)行修復(fù)。產(chǎn)孢相關(guān)蛋白主要通過(guò)維持減數(shù)分裂的正常進(jìn)行來(lái)參與擔(dān)孢子的形成，但功能預(yù)測(cè)結(jié)果并未顯示STPO1具有這方面的功能。
　　3、通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析了糙皮側(cè)耳stpo1的表達(dá)

5、模式。結(jié)果顯示，stpo1基因在子實(shí)體成熟期的表達(dá)量最高，在其他時(shí)期基本不表達(dá)；且其在成熟子實(shí)體菌褶中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于菌柄和菌肉中的表達(dá)量，在菌柄和菌肉中基本不表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明：stpo1基因只在糙皮側(cè)耳成熟子實(shí)體的菌褶中特異表達(dá)，由此表明stpo1基因可能與糙皮側(cè)耳的孢子形成有一定的關(guān)系。
　　4、采用pEASY-E2原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)stpo1進(jìn)行了原核誘導(dǎo)表達(dá)，成功獲得了與分子量預(yù)測(cè)結(jié)果相符的融合蛋白STPO1（大小約為94kD

6、a），進(jìn)一步證明本文成功克隆獲得了stpo1基因的完整編碼區(qū)，為后續(xù)研究糙皮側(cè)耳的DNA錯(cuò)配修復(fù)以及減數(shù)分裂的分子機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)。
　　5、在雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300的基礎(chǔ)上將潮霉素抗性基因上游的CaMV35S啟動(dòng)子更換為糙皮側(cè)耳的gpd啟動(dòng)子，以提高潮霉素抗性基因在糙皮側(cè)耳中的表達(dá)量。將stpo1基因的CDS區(qū)連入另外一個(gè)gpd啟動(dòng)子的下游，成功構(gòu)建了stpo1基因過(guò)表達(dá)載體；同時(shí)將stpo1的發(fā)卡結(jié)構(gòu)連入gpd啟